由動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈疾病（CAD）是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因。動脈粥樣硬化斑塊優(yōu)先在血流紊亂（DF）區(qū)域形成，如動脈分叉處，其中 DF 引起內(nèi)皮活化。磷酸酶和肌動蛋白調(diào)節(jié)因子1（PHACTR1）是高度保守的磷酸酶和肌動蛋白調(diào)節(jié)因子家族的成員之一，GWAS 研究表明，PHACTR1 位點的 SNP（單核苷酸多態(tài)性）與人類 CAD 和心肌梗死的發(fā)病、進(jìn)展和結(jié)局顯著相關(guān)。最近，有研究報道了缺失Phactr1的骨髓在體內(nèi)加重了動脈粥樣硬化。機(jī)制研究表明，巨噬細(xì)胞 PHACTR1 參與胞葬作用和巨噬細(xì)胞分化，抑制動脈粥樣硬化。

基于此，在同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心血管內(nèi)科、美國羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)和牙科學(xué)院Aab心血管研究所等科研團(tuán)隊的一項研究中，使用全身和 EC-特異性 Phactr1 KO 小鼠來確定 PHACTR1 在體內(nèi)動脈粥樣硬化中的作用。PHACTR1 在小鼠 ECs 中表達(dá)豐富，研究結(jié)果表明，在載脂蛋白E-KO（Apoe−/−）小鼠中，全身或內(nèi)皮特異性 Phactr1 的敲除顯著減弱了高脂肪、高膽固醇（HF-HC）飲食誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化，特別是在 DF 區(qū)域。機(jī)制研究顯示，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 位于 DF 下的細(xì)胞核中，通過抑制 PPARγ（過氧化物酶體增殖物激活受體γ）的轉(zhuǎn)錄活性來促進(jìn) EC 的活化。具體研究成果發(fā)表在 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice”。

首先，實驗建立了 PHACTR1 全身和條件敲除小鼠，為了確定 Phactr1 對動脈粥樣硬化的影響，又雜交建立了 Phactr1−/−Apoe−/− 小鼠模型，并給實驗組與對照組小鼠喂食 HF-HC 飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化。令人驚訝的是，敲除 Phactr1 顯著減輕了 Apoe−/− 小鼠的動脈粥樣硬化（圖1 G、L），主動脈竇、主動脈弓內(nèi)粥樣硬化斑塊面積減少（圖1 G、H），但胸/腹主動脈的動脈粥樣硬化病變面積與對照組小鼠相似（圖1 I、L）。這表明，PHACTR1 是動脈粥樣硬化發(fā)展所必需的。

然后，科研人員使用 GTEx 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn) 4 個 PHACTR1 SNPs（rs12526453、rs9349379、rs9369640、rs4714955）與 PHACTR1 mRNA 表達(dá)相關(guān)，并且在分析的49個組織中，這種關(guān)聯(lián)主要存在于非病變動脈（包括脛動脈、主動脈和冠狀動脈）中，而不在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)或其他組織中，這提示血管 PHACTR1 在動脈粥樣硬化中的作用。PHACTR1 蛋白檢測顯示，其在腦和肺中高表達(dá)，而在心臟、肝臟、脾臟、結(jié)腸和脂肪組織中沒有檢測到。此外，還觀察到 PHACTR1 在主動脈中表達(dá)，特別是在主動脈內(nèi)膜（主要是ECs）中表達(dá)，但在中膜（主要是VSMCs）和外膜中不表達(dá)。這些數(shù)據(jù)暗示了內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 在動脈粥樣硬化進(jìn)展中的潛在作用。

為了具體研究內(nèi)皮 PHACTR1 在動脈粥樣硬化中的作用，建立了 EC特異性 Phactr1 KO（Phactr1ECKO），在與Apoe−/−小鼠雜交后，生成Phactr1ECKOApoe−/− 和Phactr1f/fApoe−/− 對照小鼠，并用 HF-HC 喂養(yǎng)。與上述結(jié)果一致，Phactr1ECKOApoe−/−小鼠主動脈根部動脈粥樣硬化斑塊面積減少。EC特異性 Phactr1 KO 可顯著減輕主動脈弓區(qū)域的動脈粥樣硬化，但對胸/腹主動脈沒有作用。主動脈弓區(qū)域的血流紊亂促進(jìn)了動脈粥樣硬化斑塊的形成，研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 可能介導(dǎo)了這一過程。然后對部分頸動脈進(jìn)行結(jié)扎，觸發(fā) LCA 的振蕩流，結(jié)果表明，EC特異性 Phactr1 KO 可顯著減弱 DF 相關(guān)的動脈粥樣硬化斑塊形成。這證明，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 可以調(diào)控 DF 誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化。

圖1 全身Phactr1 KO（敲除）減輕Apoe−/−小鼠的動脈粥樣硬化。

接下來，為了研究 PHACTR1 在內(nèi)皮細(xì)胞對血流反應(yīng)中的作用，實驗檢測了 PHACTR1 在不同剪切應(yīng)力刺激的 ECs 中的表達(dá)。令人驚訝的是，EC PHACTR1 mRNA 的表達(dá)不受剪切應(yīng)力的調(diào)節(jié)。在體內(nèi)，Phactr1 mRNA 水平在假手術(shù)的 RCAs 和結(jié)扎的 LCAs 內(nèi)膜中相當(dāng)（圖2 K、L）。體外在層流（LF）高剪切力（12 dynes/cm2）或振蕩DF（±6 dynes/cm2，1 Hz）條件下，HUVECs 中 PHACTR1 mRNA 表達(dá)無明顯差異（圖2 M、N）。此外，在 LF 高剪切應(yīng)力下，PHACTR1 主要集中在細(xì)胞質(zhì)中，而在振蕩 DF 或靜態(tài)條件下，PHACTR1 集中在細(xì)胞核中（圖2 O、P）。這些數(shù)據(jù)表明，LF 保留 PHACTR1 在細(xì)胞質(zhì)中，而促動脈粥樣硬化 DF 誘導(dǎo)了 PHACTR1 核易位。

然后研究了內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 的分子功能，對小鼠主動脈ECs 進(jìn)行了 RNA-seq 分析，顯示 Phactr1−/− 小鼠的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中有191個 DEGs，其中 KEGG 通路富集在代謝和炎癥相關(guān)通路，而基因本體分析強(qiáng)調(diào)了與產(chǎn)熱、血管發(fā)育和免疫反應(yīng)相關(guān)的生物學(xué)過程。此外，功能分析表明，內(nèi)皮細(xì)胞 Phactr1 的缺失主要影響炎癥相關(guān)通路以及與血管功能和免疫反應(yīng)相關(guān)的生物過程的改變。因此，綜合全身和 EC特異性 Phactr1 KO ECs 中 DEGs 的生物信息學(xué)分析，研究人員認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 參與血管功能和炎癥反應(yīng)。

考慮到 PHACTR1 的核定位，進(jìn)一步鑒定了與 PHACTR1 相關(guān)的潛在轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn) PPARγ 和 RXRα 是排名前幾的過度表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。在具有潛在 PPARγ/RXRα 結(jié)合位點的 DEGs 中，大多數(shù)基因上調(diào)，這表明，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 的缺失增加了 PPARγ/RXRα 的轉(zhuǎn)錄活性。然后通過免疫共沉淀法探索了 PHACTR 1、PPARγ 和 RXRα 之間的潛在相互作用。PHACTR1 與 PPARγ 相關(guān)，但與 RXRα 無關(guān)，提示 PPARγ 是 PHACTR1 的直接效應(yīng)分子。隨后分析了 PHACTR1 在 PPARγ 信號傳導(dǎo)中的作用，結(jié)果表明，PHACTR1 過表達(dá)顯著抑制 PPARγ 激動劑 pioglitazone 誘導(dǎo)的激活，且 PHACTR1 通過 LXXXIXXX（I/L）基序與 PPARγ 結(jié)合，是一種潛在的 PPARγ 轉(zhuǎn)錄抑制因子。

圖2 內(nèi)皮細(xì)胞Phactr1的缺失減輕了Apoe−/− 小鼠血流紊亂區(qū)域的動脈粥樣硬化。

PPARγ 在動脈粥樣硬化中具有保護(hù)作用。研究人員推測 PHACTR1 通過抑制 PPARγ 活性在促動脈粥樣硬化血流中對 EC 激活起關(guān)鍵作用。在體外敲除 HUVECs 中 PHACTR1 后，發(fā)現(xiàn)靜態(tài)條件下，PHACTR1 缺失抑制 HUVECs 中 VCAM-1 和 ICAM-1 的 mRNA 和蛋白水平。應(yīng)用振蕩 DF 或 LF 處理后，PHACTR1 缺失降低了DF 誘導(dǎo)的 VCAM-1 和 ICAM-1 表達(dá)，并抑制 DF 誘導(dǎo)的 PBMCs 對 HUVECs 的粘附。重要的是，PHACTR1 敲低使 DF 下 HUVECs 中 PPARγ 的轉(zhuǎn)錄活性增加，且恢復(fù)了 VCAM-1 和 ICAM-1 的表達(dá)，這表明，PHACTR1 介導(dǎo)的 EC 激活是通過抑制 PPARγ 來實現(xiàn)的。在體內(nèi)實驗中，Phactr1−/− 小鼠 DF 區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞 VCAM-1 表達(dá)顯著降低。在 Apoe−/− 小鼠部分結(jié)扎頸動脈引起的動脈粥樣硬化病變中，內(nèi)皮細(xì)胞 Phactr1 缺失使巨噬細(xì)胞浸潤減少。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 通過促進(jìn)炎癥粘附因子的表達(dá)和隨后的白細(xì)胞浸潤來促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

實驗研究了 PHACTR1 是否通過抑制 PPARγ 信號通路介導(dǎo)動脈粥樣硬化，對 Phactr1ECKOApoe−/− 和 Phactr1f/fApoe−/− 小鼠進(jìn)行部分頸動脈結(jié)扎，喂食 HF-HC，并注射 PPARγ 拮抗劑 GW9662（圖3 A）。在 GW9662 給藥下，兩組小鼠之間的動脈粥樣硬化斑塊具有可比性（圖3 B、C），CD68-陽性巨噬細(xì)胞在兩組之間沒有差異（圖3 D、E ），這表明 GW9662 降低內(nèi)皮 Phactr1 KO 的保護(hù)作用。此外，GW9662 還消除了 DF 誘導(dǎo)的 Phactr1 缺失引起的 Vcam1 和 Icam1 表達(dá)降低（圖3 F、H）。這些結(jié)果表明，PHACTR1 通過抑制 PPARγ 信號介導(dǎo) EC 激活和動脈粥樣硬化。

圖3 PPARγ拮抗劑GW9662消除了Phactr1缺失對體內(nèi)內(nèi)皮活化和動脈粥樣硬化的保護(hù)作用。

I 內(nèi)皮細(xì)胞PHACTR1在內(nèi)皮活化和動脈粥樣硬化中的作用示意圖。層流下，PHACTR1存在于細(xì)胞質(zhì)中，PPARγ抑制炎癥。在流動紊亂的區(qū)域，PHACTR1位于細(xì)胞核中，作為其轉(zhuǎn)錄共抑制因子與PPARγ相互作用，上調(diào)細(xì)胞表面粘附分子的表達(dá)。白細(xì)胞附著于內(nèi)皮細(xì)胞并浸潤到血管壁，促進(jìn)動脈粥樣硬化。

總之，該研究證明，內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 是一種新的促動脈粥樣硬化分子，通過調(diào)節(jié) EC 激活作為 DF 下 PPARγ 的轉(zhuǎn)錄輔抑制因子。PPARγ 是一個理想的治療靶點，PPARγ 激動劑已成為除代謝外的內(nèi)皮功能保護(hù)劑。然而，由于 PPARγ 的普遍表達(dá)和功能的多樣性，其不良反應(yīng)如心力衰竭和肝功能障礙被觀察到。因此，使用小肽或小分子阻斷內(nèi)皮細(xì)胞 PHACTR1 和 PPARγ 的關(guān)聯(lián)可能是動脈粥樣硬化等疾病的一種很有前途的治療策略。

參考文獻(xiàn)：Jiang D, Liu H, Zhu G, Li X, Fan L, Zhao F, Xu C, Wang S, Rose Y, Rhen J, Yu Z, Yin Y, Gu Y, Xu X, Fisher EA, Ge J, Xu Y, Pang J. Endothelial PHACTR1 Promotes Endothelial Activation and Atherosclerosis by Repressing PPARγ Activity Under Disturbed Flow in Mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2023 Aug;43(8):e303-e322. doi: 10.1161/ATVBAHA.122.318173. Epub 2023 May 18. PMID: 37199156; PMCID: PMC10524336.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37199156/

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