肺癌是全球第二大常見癌癥，也是全球男性和女性癌癥相關死亡的主要原因。非小細胞肺癌 (NSCLC) 是最常見的肺癌類型，占所有病例的 80% 以上。在晚期NSCLC患者中，超過70% 的患者發生骨轉移，其中80%發生在脊柱。

當發生脊柱轉移時，常導致骨質破壞、病理性骨折、嚴重的骨痛和神經功能缺損。雖然化療、放療、手術切除等外科手術和綜合治療可以降低 NSCLC 脊柱轉移的發病率，但這些治療往往不能顯著提高總生存率。因此，迫切需要研究 NSCLC 衍生的脊柱轉移的機制，并制定預防或早期治療NSCLC脊柱轉移的策略。

腫瘤轉移涉及一系列復雜的生物學過程：腫瘤細胞從實體瘤中脫落；脫落細胞進入循環系統并形成循環腫瘤細胞（CTCs）；與其他腫瘤細胞、血小板或其他細胞聚集形成CTC簇；到達遠處器官并穿透局部血管；以及原位定植和周圍組織的相關破壞。這些過程依賴于幾種腫瘤調節因子，包括趨化因子、細胞因子和粘附分子，它們介導血管生成、腫瘤細胞存活和侵襲。

脊椎骨的紅骨髓具有特殊的血竇結構，其中含有多種細胞因子、酶和激素，尤其是趨化因子。趨化因子是一個與結構相關的小的分泌細胞因子家族，在炎癥和免疫中起著至關重要的作用。近年來，趨化因子已被證明參與調節各種腫瘤進展過程，如白細胞招募、腫瘤細胞遷移和增殖。

在這些趨化因子中，C-X3-C 基序趨化因子配體 1 (CX3CL1) 被認為是腫瘤轉移過程中必不可少的調節因子。有趣的是，CX3CL1在脊椎骨的紅骨髓中比在肢骨中更豐富，這可能是脊柱轉移瘤的原因。盡管 CX3CL1 可能在脊柱腫瘤進展中發揮作用，但 CX3CL1 對 NSCLC 脊柱轉移的幾個方面的影響，特別是對 CTC 外滲到脊椎松質骨的影響，這是腫瘤脊柱轉移的第一步和關鍵步驟，目前仍然尚不清楚。

以此為基點，上海復旦大學中山醫院骨科、胸外科以及美國密西西比州的JMS 燒傷和重建中心的多位研究學者進行了相關研究，在 Theranostics 上發表了題為《Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions》的研究論文。

因此，實驗假設脊柱中CX3CL1表達的增加促進了循環NSCLC細胞的粘附和跨內皮遷移，并引發了NSCLC脊柱轉移。

為了驗證這一假設，實驗檢測了脊椎松質骨和脊椎骨髓內皮細胞 (VBMECs) 中 CX3CL1 的含量，確定CX3CL1 是否影響循環 NSCLC 細胞的生物學行為，如粘附、跨內皮遷移和侵襲，并探討了其潛在機制。

最后，實驗研究了阻斷 CX3CL1 介導的信號傳導是否可以限制轉移并延長體內心內模型的存活期。

本研究的結果證明，CX3CL1促進了NSCLC細胞向脊椎松質骨的循環外滲，并突出了新的信號通路，為進一步研究NSCLC脊柱轉移的預防或早期治療策略提供了依據。

細胞粘附試驗

采用平行平板流動室灌注系統模擬脊椎血竇血流。在中間腔室底部植入單層VBMECs作為平行平板流動腔室的固定相，以2',7'-bis-(2-carboxyethyl)5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester 標記的腫瘤細胞為流動相，密度為5 × 105/mL，無血清培養基。加入濃度為300 × 109 pl/L的血小板(pl)。在通道中心以1000 s-1的壁切變速率灌注細胞2 min(用注射泵以0.3 mL/min的流速將血液模擬物推入平行平板流室)。細胞流經內皮細胞固定相后，將非粘附的腫瘤細胞洗去，在熒光顯微鏡下計數貼壁熒光腫瘤細胞數量。

細胞共培養

Transwell上腔室預涂有Matrigel。在血清過夜后，將對照A549、shCX3CR1-A549、對照H1975或shCX3CR1-H1975細胞以20,000個細胞的密度接種到含有100 µL 條件培養液的上腔室，培養基為對照或敲除CX3CL1(CX3CL1-KD)的VBMECs，用10%的胎牛血清，培養6天。此外，由指定的A549或H1975細胞和VBMEC培養基組成的培養系統用AKT抑制劑MK-2206 2HCI (3 µM) 或PI3K抑制劑LY294002 (20 µM) 處理。在顯微鏡下測定細胞數。每孔中隨機選取5個區域，通過計數染色細胞數量來定量分析。

VBMECs 通過 CX3CL1 信號介導的 PI3K/AKT 通路激活增強 NSCLC 細胞的侵襲

作為一種趨化因子，CX3CL1 已被證明可以促進癌細胞的侵襲。為了研究 CX3CL1 在 VBMECs 中的表達增加是否通過加速細胞侵襲來促進 NSCLC 脊柱轉移，實驗將A549細胞與VBMECs條件培養液一起培養，使用Transwell實驗來量化NSCLC細胞的侵襲。

與對照相比，在條件培養液中生長的 A549 細胞的侵襲能力提高了約 3 倍；與對照組相比，腫瘤細胞的侵襲性增加了3 倍（圖1 B-C）。VBMECs 中 CX3CL1 的基因消融最小化了VBMECs導致的A549細胞侵襲增加（圖1 A-C，P< 0.01)。

此外，在A549細胞中沉默CX3CR1 (CX3CL1的唯一受體)，顯著降低了VBMEC誘導的細胞侵襲(P < 0.01)，表明CX3CL1/CX3CR1功能性地介導了VBMEC對NSCLC細胞侵襲的影響。這些結果表明 VBMECs 通過 CX3CL1 依賴性信號通路促進 NSCLC 細胞侵襲。

為了研究CX3CL1介導的NSCLC細胞侵襲是否通過上皮-間充質轉化 (EMT) 發生，實驗檢測了在VBMECs條件培養液培養后A549細胞中EMT標記物的表達水平。然后還分析了幾種基質金屬蛋白酶 (MMPs) 的表達，已知這些蛋白酶參與基質降解，而基質降解是細胞侵襲的重要組成部分。

結果發現，VBMECs 通過 CX3CL1 依賴性促進 EMT 和 MMP 介導的基質降解來上調 NSCLC 細胞侵襲（圖 1 D）。

此外，實驗檢測了 PI3K 和 AKT 的表達水平。與VBMECs條件培養液共培養有效促進A549細胞PI3K和AKT磷酸化，PI3K和AKT總表達水平無明顯變化，表明PI3K和AKT磷酸化參與VBMEC介導的促進NSCLC細胞的侵襲能力（圖1 E)。

為了證實PI3K/AKT通路在VBMECs調控的NSCLC細胞侵襲中的作用，實驗使用了PI3K抑制劑LY294002和AKT抑制劑MK-2206 2HCI。

有趣的是，與條件培養液處理的對照組相比，LY294002 和 MK-2206 2HCI 處理的 A549 細胞顯著抑制了侵襲能力，逆轉了 VBMECs 引起的變化（圖1 F-G）。蛋白質印跡分析表明，LY294002 或 MK-2206 2HCI 恢復了條件培養液處理的 A549 細胞中降低的 鈣黏蛋白表達，而 LY294002 或 MK-2206 2HCI 處理可降低Vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白的上調（圖1 H）。

總體而言，這些數據表明，VBMECs 通過以 CX3CL1/CX3CR1 依賴性方式激活 PI3K/AKT 通路，賦予 NSCLC 細胞侵襲優勢。

圖1 VBMECs 通過 CX3CL1 信號介導的 PI3K/AKT 通路激活增強了 NSCLC 細胞的侵襲。

CX3CL1 通過ICAM-1 依賴性激活Src/GEF-H1 通路增加 VBMECs 的通透性，從而增強 NSCLC 細胞的跨內皮遷移

跨內皮遷移是腫瘤轉移的關鍵步驟，因此，實驗研究了 CX3CL1 對 NSCLC 細胞跨內皮遷移的影響（圖2 A）。如圖2 C和圖3 B，NSCLC細胞通過CX3CL1- KD VBMEC屏障的細胞數量明顯低于通過對照組VBMEC屏障的細胞數量，因此NSCLC細胞的跨內皮遷移需要CX3CL1。

此外，VBMECs 中的 ICAM-1 過表達挽救了 CX3CL1-KD 抑制 NSCLC 細胞跨內皮遷移的有效性，表明 CX3CL1 介導的 NSCLC 細胞跨內皮遷移需要 ICAM-1 信號傳導（圖 2 B-C 和圖 3 A-B）。

為了研究 CX3CL1 / ICAM-1 介導的 NSCLC 細胞跨內皮遷移的機制，使用 FITC 標記的跨內皮葡聚糖通量來檢測單層內皮細胞通透性。如圖2 D，CX3CL1基因切除顯著抑制葡聚糖的轉運，而ICAM-1的過表達顯著挽救了CX3CL1切除降低經內皮細胞葡聚糖轉運的功效。

蛋白質印跡分析表明，CX3CL1基因抑制顯著降低了VBMECs中Rho 相關激酶1 (ROCK1) 的表達，降低了Ras Homolog Family Member A (RhoA)和myosin light chain (MLC) 的磷酸化水平，而 ICAM-1 過表達則逆轉了這一變化。（圖2 E 和圖3 C）。

考慮到經內皮細胞的葡聚糖轉運直接反映了VBMEC的通透性，而ROCK1、RhoA和MLC是調控細胞骨架的關鍵分子，我們認為CX3CL1可以通過以ICAM-1依賴性的方式有效上調VBMEC的通透性，從而導致NSCLC細胞的跨內皮遷移增加。

鑒于 CX3CL1 和 ICAM-1 并不直接調控 VBMECs 的通透性，應該有其他信號通路負責改變 VBMEC 通透性。如在所示圖2的F-G和圖3 D、F，ICAM-1的基因切除顯著降低了Src的磷酸化和GEF-H1的表達，并降低了ROCK1、p-RhoA和p-MLC的水平。

此外，當使用Src信號通路激動劑三苯氧胺時，ICAM-1沉默誘導的ROCK1、p-RhoA和p-MLC水平的降低被顯著逆轉（圖2 G和圖3 F）。此外，ICAM-1-KD可抑制葡聚糖轉運，這種效果被三苯氧胺逆轉（圖2 H）。此外，ICAM-1可顯著降低腫瘤細胞的跨內皮遷移，使用三苯氧胺也可以逆轉這種情況（圖2 I 和圖3 G）。

總的來說，CX3CL1 可以通過ICAM-1 依賴性激活Src/GEF-H1 通路，增加 VBMEC 的通透性，從而誘導 NSCLC 細胞的跨內皮遷移。

圖2 CX3CL1/ICAM-1通過Src/GEF-H1途徑增加VBMEC的通透性，從而增強NSCLC細胞的跨內皮遷移

圖3

綜上所述，該研究結果表明，脊椎骨中高表達的 CX3CL1 / ICAM-1 通過驅動循環 NSCLC 細胞和 VBMECs 之間的脊柱特異性惡性循環來促進 NSCLC 脊柱轉移。

該循環基于 CX3CL1 / ICAM-1 介導的 NSCLC 細胞-VBMEC 的相互作用，從而增強腫瘤細胞的侵襲性和粘附性，改善VBMEC的通透性，并通過多種信號通路增加 NSCLC 細胞的跨內皮遷移。該研究中描述的機制可能為預防NSCLC脊柱轉移提供潛在的新靶點。

參考文獻：
Wang K, Jiang L, Hu A, Sun C, Zhou L, Huang Y, Chen Q, Dong J, Zhou X, Zhang F. Vertebral-specific activation of the CX3CL1/ICAM-1 signaling network mediates non-small-cell lung cancer spinal metastasis by engaging tumor cell-vertebral bone marrow endothelial cell interactions. Theranostics. 2021 Mar 4;11(10):4770-4789. doi: 10.7150/thno.54235. PMID: 33754027; PMCID: PMC7978319.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33754027/

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