細(xì)菌內(nèi)毒素是在革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)的有毒物質(zhì)。脂多糖（LPS）是內(nèi)毒素的主要有毒物質(zhì)，緊密結(jié)合到其細(xì)胞壁的最外層，當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出來。人類胃腸道具有大量復(fù)雜的共生和有害革蘭氏陰性細(xì)菌，當(dāng)腸黏膜屏障完好時，它們不會損害腸腔。然而，當(dāng)腸黏膜免疫屏障受損時，許多內(nèi)毒素會轉(zhuǎn)移到血液中，引起內(nèi)毒素血癥。因此，確保腸黏膜屏障的完整性是防止內(nèi)毒素易位的關(guān)鍵。

在腸道組織結(jié)構(gòu)中，杯狀細(xì)胞分布于整個腸道，杯狀細(xì)胞能夠分泌黏蛋白（黏蛋白-2（MUC2）是腸黏液層主要成分），高度糖基化的黏蛋白分布于細(xì)胞膜或者分泌進(jìn)腸腔中，形成黏液層。病原微生物必須先突破黏液層才能到達(dá)上皮細(xì)胞，因此，黏液層是腸道屏障的第一道防線，能夠保護(hù)腸道上皮細(xì)胞免受病原微生物的侵襲。先前的研究表明，在黏液層存在的情況下，內(nèi)毒素不會損害腸上皮細(xì)胞。假設(shè)黏液層的缺失是由內(nèi)毒素易位到腸上皮細(xì)胞引起的。然而，在沒有黏液層的情況下首先被內(nèi)毒素破壞的上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能尚不清楚。

在西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院、榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院的一項聯(lián)合研究中，基于腸道屏障功能，建立了Caco-2和HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞模型，對腸道黏液層內(nèi)毒素的作用機(jī)制進(jìn)行探索。此外，采用siRNA轉(zhuǎn)染分析、RNA-seq、qPCR、ELISA和免疫熒光分析評估了LPS處理后Caco-2/HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)的增殖、結(jié)構(gòu)、功能和機(jī)制。研究結(jié)果反映了內(nèi)毒素對腸黏膜屏障作用的調(diào)控機(jī)制，為深入了解腸黏膜免疫屏障功能提供了思路。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells”。

HT-29細(xì)胞常用作體外杯狀細(xì)胞模型，可產(chǎn)生黏蛋白分泌物，形成細(xì)胞外黏液層。Caco-2（人結(jié)腸腺癌細(xì)胞）結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細(xì)胞，可以用來進(jìn)行模擬體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運的實驗。研究人員選擇Caco-2和HT-29在Transwell腔室中共培養(yǎng)的組合，以確保建立的腸上皮模型具有黏液層（圖1 A）。ALPi是Caco-2細(xì)胞分化的標(biāo)志物，MUC5AC是HT-29細(xì)胞分化的標(biāo)志物，MUC2是形成黏液層骨架的主要成分。在15天分化過程結(jié)束時，Caco-2/HT-29（3：1）共培養(yǎng)物中的 MUC2 和 MUC5AC mRNA 表達(dá)相對于 Caco-2/HT-29 （9：1）共培養(yǎng)物中的表達(dá)顯著增加（圖1 B、C）。這些數(shù)據(jù)表明，Caco-2：HT-29 接種比率為 3：1 在腔室15 天分化結(jié)束時黏液屏障最佳。

此外，為了確認(rèn)LPS的最佳時間和劑量對黏液屏障功能的影響，在Caco-2/HT-29共培養(yǎng)分化15天后，使用100、200、400、800和1000 μg/mL LPS分別在12、24、36、48小時刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞。根據(jù)觀察結(jié)果，后續(xù)測試選擇400 μg/mL LPS刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞。實驗還觀察到，LPS（+）組在LPS刺激12、24、36和48 小時后，與LPS（-）組相比，黏蛋白分泌顯著增加。此外，使用免疫熒光檢測，評估了不同時間點Caco-2 / HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞中Occludin 跨膜蛋白的表達(dá)，以評估緊密連接。LPS（-）組中Caco-2/HT-29細(xì)胞在24、36和48小時具有良好的細(xì)胞膜連接性，相反，LPS（+）組細(xì)胞膜連接受損。這些結(jié)果表明，LPS（-）和LPS刺激24小時的LPS（+）組的Caco-2/HT29共培養(yǎng)細(xì)胞中的黏蛋白分泌和Occludin表達(dá)顯著增加。

圖1 建立Caco2/HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)模型。（A）Caco-2 / HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞模型的Transwell。（B）Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞在兩種細(xì)胞接種比例下MUC2、MUC5AC和ALPi mRNA表達(dá)。（C）兩種細(xì)胞接種比例下的Caco-2/ HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞的圖像。

接下來，為了了解黏液層的功能，使用RNA干擾（RNAi）來沉默Caco-2/HT-2共培養(yǎng)細(xì)胞中的MUC2基因，評估MUC2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)。Caco-2/ HT-29共培養(yǎng)分化15天后，在24、36、48和60小時用LPS（LPS +）或0.01M PBS （LPS-）刺激細(xì)胞。LPS（+）組和LPS（-）組MUC2 mRNA和蛋白質(zhì)在24小時時的表達(dá)水平高于其他時間點。因此，Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細(xì)胞在LPS刺激24小時前用Lipofectamine™2000轉(zhuǎn)染siRNA MUC2構(gòu)建物。這些綜合結(jié)果表明，用siRNA轉(zhuǎn)染和LPS刺激24小時后，MUC2 mRNA表達(dá)顯著增加。因此，在下面的測試中，所有共培養(yǎng)的細(xì)胞被分為三組，即LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）。

為了深入了解LPS對黏液層的調(diào)控機(jī)制，實驗使用RNA-seq技術(shù)分析了LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的不同基因和KEGG富集途徑。在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中共發(fā)現(xiàn)了1611個上調(diào)基因和1379個差異表達(dá)基因。在LPS（-）組與 siMUC2 + LPS（+）組中分別有1417個和1904個基因上調(diào)和下調(diào)，LPS（-）組與 LPS（+）組分別有71個基因上調(diào)和82個基因下調(diào)（圖2 A）。在 LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組之間共發(fā)現(xiàn)1953個差異表達(dá)基因（圖2 B）。通過KEGG富集分析測定LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組的前20條信號通路（圖2 C）。利用細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用和黏著斑信號通路進(jìn)一步研究黏液層功能機(jī)制。

圖2 LPS（+）組、LPS（-）組和siMUC2+LPS（+）組的RNA-seq。（A）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與LPS（+）組中不同基因的數(shù)量，紅色表示上調(diào)基因，藍(lán)色表示下調(diào)基因。（B）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與LPS（+）組中不同基因簇的維恩分析。（C）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組（右列）和 LPS（-）與 siMUC20+LPS（+）組（左列）的 KEGG 富集分析。

最后，為了了解參與ECM-受體相互作用和黏著斑通路的不同基因，使用qPCR測量了這些因子在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，與siMUC2 + LPS組相比，LPS（+）組Claudin-1、ZO-1、JAMA、Desmosome、Occludin和E-cadherin 的mRNA表達(dá)水平顯著升高；FN1，ITGAV，COL6A2，LAMC1，LAMA5，LAMB2，AGRN，ROCK1，ITGB2，ITGB4，ACTB-P1，CD44，ARHGAP5，HSPG2，DAG1和SRC的mRNA表達(dá)水平顯著增加。LPS（+）組和 siMUC2 +LPS（+）組之間 ITGB3、ROCK2 和 RhoA 的 mRNA 表達(dá)量無差異。

圖3 ECM受體相互作用和黏著斑信號通路的圖像。（A）腸上皮細(xì)胞黏液層結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間黏附及細(xì)胞-基質(zhì)黏附。（B）ECM受體相互作用和黏著斑信號通路差異因子的相互作用機(jī)制。

總之，除了能夠建立Caco-2/HT-29模型的數(shù)據(jù)外，該研究還支持其作為評估腸道黏液屏障的有力工具的使用。在共培養(yǎng)細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)LPS（400 μg/ mL）刺激24小時后，可破壞MUC2基因沉默下ECM介導(dǎo)的黏著斑信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制。當(dāng)黏液層不完整時，LPS首先破壞上皮細(xì)胞的緊密連接，通過ECM向下游傳遞信號調(diào)控細(xì)胞表面受體的整合素，抑制整合素介導(dǎo)的黏著斑結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步破壞ECM網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白微絲骨架。最終，LPS抑制ECM和細(xì)胞骨架之間的相互作用。通過結(jié)合這些數(shù)據(jù)，黏液屏障的保護(hù)功能有望在未來得到很好的表征。

參考文獻(xiàn)：Hu W, Feng P, Zhang M, Tian T, Wang S, Zhao B, Li Y, Wang S, Wu C. Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells. Front Immunol. 2022 Jun 10;13:916933. doi: 10.3389/fimmu.2022.916933. PMID: 35757703; PMCID: PMC9226665.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35757703/

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