牙周膜（PDL）是位于牙根與牙槽骨間的致密結締組織，具有固定牙根和緩解咀嚼時所產生壓力的作用。它在維持組織穩態方面起重要作用，并為機械刺激下的炎癥反應和骨重塑提供微環境。牙周韌帶干細胞（PDLSCs）作為PDL微環境中的主要間充質干細胞，表現出克隆形成能力、增殖性、多向分化和免疫調節特性。它們通過產生高水平的炎性細胞因子和趨化因子來響應機械應力，這些細胞因子和趨化因子在牙槽骨改建中起著至關重要的作用。然而，PDLSCs感知機械刺激并將其轉化為生物信號，從而促進牙槽骨改建的機制仍有待進一步研究。

瞬時受體電位（TRP）通道是典型的機械敏感通道，在各種類型的組織和細胞中感受細胞內外各種刺激。瞬時受體電位香草素受體 4 型通道蛋白（TRPV4）能被多種理化刺激激活，調節機械感覺，炎癥和能量穩態。從TRPV4敲除小鼠中分離出的間充質干細胞被發現成骨潛能受損。因此，有研究假設PDLSCs的干細胞特性受到機械刺激下TRPV4激活的影響，從而促進牙槽骨改建并最終影響牙齒移動。

口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室、北京大學口腔醫院的一項研究曾使用機械力誘導的牙齒移動和體外壓縮力刺激的動物模型，評估了PDLSCs在機械刺激下的生物學變化，包括其克隆性，增殖，多向分化和免疫調節特性，證明了PDLSCs中TRPV4的普遍上調及其在機械力作用下的潛在分子機制。這些結果共同闡明了機械應力誘導的TRPV4在調節PDLSCs干細胞特征和介導骨重塑方面的重要性。

機械應力在骨重塑和牙齒移動過程中誘導PDLSCs的增殖和炎癥因子的表達

實驗首先建立機械負荷牙齒移動實驗動物模型（圖1 A）。雙重免疫染色顯示，大多數Ki67陽性細胞（表明細胞增殖）與牙周組織中的CD146（MSCs的表面標志物）共定位。在施加應力后第3天，CD146 Ki67 PDLSCs的比例增加到5.1±1.9%，在第7天達到10.4±2.8%，表明機械應力刺激后PDLSCs的增殖能力增強（圖1 B）。TRAP陽性破骨細胞在機械負荷期間積聚在牙槽骨附近的牙周組織中聚集（圖1 C）。此外，機械應力后，促炎細胞因子IL-6和IL-1β的水平在牙周組織的壓力側增加（圖1 D）。因此，機械應力促進PDLSC在體內增殖，這可能是促炎因子積累和牙周組織周圍破骨細胞分化的原因。

圖1 牙周膜干細胞（PDLSCs）和破骨細胞在體內施加機械力后積聚在牙周組織的壓力側。

機械應力改變了 rPDLSCs 的 MSC 特性

盡管據報道PDLSCs具有自我更新和多向分化潛力，但它們在骨重塑過程中機械刺激下的詳細特征仍有待闡明。該研究分離了有或沒有機械加載的rPDLSCs，并應用了多種實驗技術對其進行表征。

CCK-8檢測顯示，力刺激的rPDLSCs（F-PDLSCs）的增殖強于正常PDLSCs（N-PDLSC），這與體內現象一致（圖2 A）。兩種細胞類型從0-3天緩慢增殖。然而，從3-7天，F-PDLSCs比N-PDLSCs生長得更快。 此外，與N-PDLSCs相比，F-PDLSCs顯示出更強的集落形成能力（圖2 B）。然后評估了它們的多向分化能力，結果表明，N-PDLSCs產生的礦化結節（用茜素紅S染色）明顯多于F-PDLSCs（圖2 C）。定量分析表明，F-PDLSCs中脂質特異性油紅O陽性細胞的數量少于N-PDLSCs（圖2 D）。這些數據表明，rPDLSCs在體內機械刺激后表現出更大的增殖和降低的分化能力。

為了評估rPDLSCs的免疫調節功能，用F-PDLSCs或N-PDLSCs和RAW264.7巨噬細胞進行了Transwell遷移測定。結果發現，與N-PDLSC組相比，來自F-PDLSCs的條件培養基明顯促進了巨噬細胞的遷移（圖2 E）。然后通過與rPDLSC和RAW264.7巨噬細胞的細胞間接觸共培養系統進一步評估了旁分泌對F-PDLSCs破骨細胞分化的影響。TRAP染色顯示，與N-PDLSC組相比，F-PDLSCs增強了破骨細胞分化（圖2 F）。此外，還評估了體外分離的rPDLSCs中促炎因子的表達。在F-PDLSCs中，IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA水平升高（圖2 G）。此外，機械加載后Ki67蛋白水平上調，進一步證實了CCK-8測定的結果（圖2 H）。

這些結果共同表明，F-PDLSCs的積極旁分泌作用，包括巨噬細胞遷移和誘導破骨細胞分化，可能歸因于F-PDLSCs中促炎因子表達增強。總之，體內的機械刺激可能會改變rPDLSCs的MSC特征，從而有助于骨重塑和牙齒移動。

圖2 體外力誘導的rPDLSCs的生物學特性。

TRPV4 通道在力刺激的 rPDLSCs 中被激活

接下來，實驗確定了rPDLSCs如何感知機械力并將其轉化為生物信號。先前的研究表明，TRPV通道對微環境溫度，機械和化學刺激敏感。因此檢測了rPDLSCs中TRPV通道的mRNA水平。在rPDLSCs中檢測到TRPV1-4的mRNA表達，而F-PDLSCs中檢測到TRPV4的mRNA表達增加（圖3 A）。F-PDLSCs中的TRPV4蛋白水平也約為N-PDLSCs的四倍，與mRNA水平一致（圖3 B）。

為了確認體內機械負荷后TRPV4表達增加，在機械力介導的牙齒移動過程中對TRPV4和CD146進行了雙重免疫染色。加載力后，CD146TRPV4 PDLSCs的比例在第3天增加到3.9±0.9%，第7天增加到7.3±1.3%（圖3 C）。這些結果表明，TRPV4作為機械力傳感器，在機械刺激后在PDLSCs中被激活，這可能將機械刺激的轉導與隨后的生物反應聯系起來。

圖3 TRPV4存在于體外F-PDLSCs中。

抑制 TRPV4 可抑制力刺激的 rPDLSCs 的生物學特性

為了探究TRPV4是否參與在機械力作用下調節PDLSC功能，應用TRPV4 小分子拮抗劑GSK2193874在功能上確認其對F-PDLSCs的影響。 CCK-8 測定表明，GSK219 在 10 μmol/L 濃度下抑制了 F-PDLSCs 增殖速率的增強（圖4 A）。GSK219處理也降低了F-PDLSCs的集落形成能力（圖4 B）。此外，用GSK219處理后，F-PDLSCs和單核細胞共培養中的TRAP破骨細胞分化顯著下降（圖4 C）。免疫熒光染色顯示，GSK219處理抑制了F-PDLSCs中IL-6的表達（圖4 D）。此外，GSK219處理后，F-PDLSCs的IL-1β、TNF-α、IL-6和MCP-1的mRNA水平降低（圖4 E）。這些結果共同表明，力誘導的TRPV4參與調節F-PDLSCs的增殖能力和集落形成能力，并通過分泌炎癥相關基因介導旁分泌效應對破骨細胞分化的影響。

圖4 抑制TRPV4抑制了體外F-PDLSCs的生物學特性。

hPDLSCs 中TRPV4 在體外機械力下調節NF-κB 配體/骨保護素比值

TRPV4在牙齒移動過程中的骨重塑過程中被激活，并調節力誘導的PDLSCs生物學特性。 因此，實驗評估了PDLSCs中TRPV4表達在體外機械力下調節破骨形成的機制。靜態壓縮力（0-1.5 g/cm2，12 小時）處理的hPDLSCs顯示TRPV4蛋白水平呈劑量依賴性增加。hPDLSCs中IL-6和TNF-α的mRNA水平在體外壓縮力加載后上調，并由GSK219下調（圖5 A）。蛋白質印跡結果一致顯示，體外壓縮力加載后Ki67蛋白水平上調，并由GSK219下調（圖5 B）。此外，通過蛋白質印跡評估破骨細胞分化所必需的NF-κB配體/骨保護素受體激活劑（RANKL/OPG）的比例。體外壓縮力上調了hPDLSCs中的RANKL蛋白水平，用GSK219處理可以逆轉。相比之下，OPG水平沒有顯著變化。因此，施加壓縮力后，RANKL/OPG比值增加，并且通過與GSK219同時處理部分阻斷了這種效應（圖5 C）。這些發現證實了hPDLSCs中力誘導的TRPV4可能通過影響RANKL/OPG系統來調節破骨細胞過程。

接下來研究了hPDLSC中TRPV4調節破骨細胞生成的信號通路。ERK蛋白激酶可以通過TRPV4信號激活。此外，ERK還參與了RANKL/OPG的轉錄調控。因此，假設機械力誘導的hPDLSC中TRPV4的上調可能通過觸發ERK信號通路來增加RANKL / OPG比值。為此，在體外施加壓縮力之前，用TRPV4的小分子激動劑或拮抗劑對hPDLSC進行預處理。蛋白質印跡結果顯示，壓縮力導致hPDLSCs中ERK快速磷酸化，TRPV4抑制劑GSK219的額外干預部分減弱了這一磷酸化（圖5 D）。此外，在hPDLSC中添加TRPV4激動劑GSK101（10 nmol/L）可增強機械力刺激后ERK磷酸化的誘導（圖5 E）。這些結果表明，hPDLSCs中力誘導的TRPV4通過ERK信號通路影響RANKL / OPG系統來調節破骨細胞分化。

圖5 TRPV4通過ERK信號通路調節hPDLSCs中力誘導的炎癥相關基因表達和核因子-κB配體（RANKL）/骨保護素（OPG）系統的受體激活劑。

圖6 PDLSCs中TRPV4在機械應力作用下的激活有助于其生物學性質的變化，并調節牙齒移動過程中的骨重塑。

總之，該研究表明，PDLSCs中TRPV4在機械力下的激活有助于其生物學性質的變化，包括克隆性，增殖，多能分化和免疫調節，并調節牙齒移動過程中的骨重塑（圖6）。這些結果表明PDLSCs在機械力誘導的骨重塑中具有關鍵作用，并表明TRPV4在調節PDLSC功能和介導機械力下骨重塑中的重要性。研究結果還表明，靶向TRPV4可能有益于機械力誘導的骨重塑和牙齒移動。

參考文獻：Jin SS, He DQ, Wang Y, Zhang T, Yu HJ, Li ZX, Zhu LS, Zhou YH, Liu Y. Mechanical force modulates periodontal ligament stem cell characteristics during bone remodelling via TRPV4. Cell Prolif. 2020 Oct;53(10):e12912. doi: 10.1111/cpr.12912. Epub 2020 Sep 22. PMID: 32964544; PMCID: PMC7574874.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32964544/

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