一般來說，腰椎的承受壓力過大被認(rèn)為是退行性椎間盤疾病（DDD）的主要原因。由不良的生活方式或肥胖引起的過度脊柱負(fù)荷可導(dǎo)致椎間盤（IVD）細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的代謝紊亂。此外，過度的脊柱負(fù)荷會提高促炎基因的表達(dá)，例如Cox2，IL-6、IL-8。炎癥通常被認(rèn)為是有害因素，并參與DDD的發(fā)作。因此，緩解炎癥反應(yīng)以恢復(fù)IVD結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。作為IVD的重要組成部分，AF（纖維環(huán)）可以緩沖脊柱旋轉(zhuǎn)或彎曲引起的力學(xué)負(fù)荷，并有助于預(yù)防NP（髓核）突出。細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)是纖維環(huán)退變的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)表明，機(jī)械信號在調(diào)節(jié)AF修復(fù)和再生中起著關(guān)鍵作用。

有研究發(fā)現(xiàn)，整合素信號通路通過核因子κB（NF-κB）的核易位調(diào)控機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明NF-κB家族的激活狀態(tài)。NF-κB活化的增加加速了炎癥和分解代謝基因的轉(zhuǎn)錄，如IL-6，IL-8，Cox2，Adamts4和Adamts5。此外，NF-κB的激活在關(guān)節(jié)軟骨和終板的張力相關(guān)的退行性變化中起核心作用，并且在退行性椎間盤中可以觀察到NF-κB活性升高。然而，力學(xué)刺激如何控制退行性椎間盤中整合素β1表達(dá)水平和NF-κB的活性仍在很大程度上尚不清楚。

Cav1（小窩蛋白-1）是胞膜窖（caveolae）的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，可作為力學(xué)傳感器響應(yīng)來自細(xì)胞微環(huán)境的各種力學(xué)刺激。例如，Cav1通過充當(dāng)力學(xué)傳感器來感知剪切應(yīng)力，壓力和拉伸應(yīng)力，從而參與整合素介導(dǎo)的炎癥信號通路。此外，在IVD退變過程中，Cav1基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平升高，并且在用 IL-1β 處理的IVD細(xì)胞中可以檢測到Cav1的高表達(dá)，以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。因此，闡明Cav1、整合素β1和NF-κB在力學(xué)負(fù)荷誘導(dǎo)的退行性進(jìn)展中的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，并分析它們之間的關(guān)系，對于DDD治療具有重要意義。

在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科、中國骨科再生醫(yī)學(xué)學(xué)組的一項(xiàng)聯(lián)合研究中，探索了Cav1在AF退變過程中整合素β1和NF-κB信號通路的機(jī)械調(diào)控中的作用。研究表明，通過適度的力學(xué)刺激靶向Cav1和整合素β1介導(dǎo)的NF-κB信號通路失活可以挽救細(xì)胞炎癥。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，適度的應(yīng)力牽引可修復(fù)退變的椎間盤。這些成果為理解適度運(yùn)動的對退變組織康復(fù)治療提了理論基礎(chǔ)。

為了評估應(yīng)力刺激對AFC（纖維環(huán)細(xì)胞）行為的影響，實(shí)驗(yàn)用單軸循環(huán)牽引力（CTS，0.2HZ）處理AFCs，分別使用 0%（Ctrl）、2%、5% 和12% 不同幅度的CTS 持續(xù)應(yīng)用24 h。5% 或12% CTS處理時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)榧忓N狀。而且用5% CTS處理后S期細(xì)胞的百分比顯著增加，表明5% CTS的細(xì)胞增殖水平高于其他組。此外，5% 的CTS顯著促進(jìn)了AFC的遷移。基于上述結(jié)果，5% 的CTS可以被認(rèn)為是適度的力學(xué)刺激，可能有利于細(xì)胞生長。相比之下，12% 的CTS對細(xì)胞生長有負(fù)面影響，因此被認(rèn)為是過度的力學(xué)負(fù)荷。

接下來研究了AFCs中ECM相關(guān)蛋白（膠原蛋白I，膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖）的表達(dá)。與靜態(tài)條件下和2% 或12% CTS下的細(xì)胞相比，在5% CTS下AFCs中，膠原蛋白I，膠原蛋白II和聚集蛋白聚糖的表達(dá)水平更高（圖1）。因此，5% 被認(rèn)為是CTS控制AFCs合成代謝的適度機(jī)械量級。這些結(jié)果還表明，適度的力學(xué)刺激可以促進(jìn)ECM的合成，并有可能促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。

圖1 應(yīng)力刺激對AFCs基質(zhì)合成代謝的影響。采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測不同牽引力條件下AFCs合成代謝基質(zhì)（膠原蛋白I、膠原II和聚集蛋白聚糖）的表達(dá)水平。

鑒于牽引力刺激對AFCs生長和代謝的影響，實(shí)驗(yàn)通過評估促炎基因的表達(dá)，進(jìn)一步探討了CTS 24 h后AFCs的炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，在12% CTS的AFCs中，包括Cox2，Tnfa，IL-1b和IL-6在內(nèi)的促炎基因顯著增加。然而，與靜態(tài)條件相比，5% CTS對AFCs促炎基因的表達(dá)沒有明顯影響（圖2 A）。這可能是由于這些促炎基因在靜態(tài)條件下AFCs中的低表達(dá)所致。由于5% CTS有利于細(xì)胞生長，推測該水平的力學(xué)刺激可以對AFCs產(chǎn)生抗炎作用，因此用IL-1β處理AFCs以誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)，然后使用5% CTS 刺激。結(jié)果表明，5% CTS能夠顯著逆轉(zhuǎn)IL-1β處理的AFCs中促炎基因的升高表達(dá)（圖2 B）。這些結(jié)果表明，5% 的CTS減弱了IL-1β誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但12% 的CTS加劇了這一過程。

圖2 應(yīng)力刺激對AFCs促炎基因mRNA表達(dá)的影響。

（A）不同牽引力加載條件下AFCs中促炎基因（Cox2，Tnfa，IL-1b和IL-6）相對表達(dá)的qPCR分析。（B）在存在或不存在IL-1β的情況下，用5% CTS處理的AFCs中促炎基因（Cox2，Tnfa，IL-1b和IL-6）相對表達(dá)的qPCR分析。

為了研究不同應(yīng)力負(fù)荷處理的AFCs中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組變化，采用RNA測序來量化AFCs中的mRNA水平。基因表達(dá)熱圖顯示，5% CTS組和Ctrl組的表達(dá)模式相似，而與 12% CTS組的表達(dá)模式差異很大，表明在12% CTS處理下，AFCs發(fā)生了顯著變化。之后GO和通路富集分析，12% CTS上調(diào)的前七個(gè)生物過程或通路，其中炎癥反應(yīng)、分解代謝過程和凋亡通路被激活，而細(xì)胞增殖呈負(fù)調(diào)控。具體而言，在12% CTS處理的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)炎癥基因（Ptgs2，IL-6，NFkB1等），力學(xué)敏感基因（Cav1，Itgbl1，Itga3等）和分解代謝基因（Mmp17，Mmp3，Timp1等）的顯著上調(diào)，合成代謝基因（Col2a1，Col11a1，Col14a1等）下調(diào)。相反，與對照組相比，5% CTS組的小分子生物合成過程、ECM組織和細(xì)胞增殖均上調(diào)。熱圖顯示，用5% CTS處理的細(xì)胞中合成代謝基因（Col27a1，Col6a3，Col4a4等）上調(diào)，表明5% CTS對AFCs有益。

為了闡明CTS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)背后的機(jī)械信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在CTS刺激后直接檢查了兩種力學(xué)敏感蛋白Cav1和整合素β1的水平。顯然，Cav1和整合素β1的表達(dá)在5% CTS組中下調(diào)，這可能導(dǎo)致細(xì)胞對物理信號的敏感性降低。相比之下，12% CTS顯著增加了這兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)（圖3 A、B）。通過免疫熒光檢測Cav1蛋白表達(dá)的細(xì)胞定位。有趣的是，Cav1出現(xiàn)在AFCs的細(xì)胞質(zhì)膜上，并且在CTS為 5% 或12% 時(shí)核Cav1 沒有進(jìn)一步增加（圖3 C）。同樣，整合素β1在靜態(tài)和機(jī)械條件下也位于細(xì)胞質(zhì)膜上（圖3 D）。現(xiàn)在，這兩種力學(xué)敏感蛋白在任何應(yīng)力刺激條件下總是存在于AFCs的細(xì)胞質(zhì)膜上，它們可能會通過下游的細(xì)胞內(nèi)信號通路將外部力學(xué)線索轉(zhuǎn)化為特定的生物信號。p65細(xì)胞核易位在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)促炎反應(yīng)中起重要作用。根據(jù)免疫熒光結(jié)果，p65在靜態(tài)和5% CTS條件下位于細(xì)胞質(zhì)中，但在12% CTS條件下迅速易位到細(xì)胞核中（圖3 E）。這些數(shù)據(jù)表明，這兩種蛋白質(zhì)可能參與CTS誘導(dǎo)的AFC炎癥反應(yīng)，其功能可能依賴于p65的細(xì)胞核易位。

圖3 CTS處理的AFCs中Cav1和整合素β1的表達(dá)變化。

（A、B）不同力學(xué)條件下AFCs中Cav1和整合素β1蛋白表達(dá)的變化。（C-E）不同力學(xué)條件下Cav1、整合素β1和p65在AFCs中的定位。

為了確定Cav1參與過度CTS誘導(dǎo)的炎癥，使用小干擾RNA（siRNA）雙鏈體來抑制AFCs中的Cav1。結(jié)果表明，12% CTS處理的AFCs中敲低Cav1導(dǎo)致促炎基因水平降低。隨后過表達(dá)Cav1，這增加了p65磷酸化（p-p65）的蛋白質(zhì)水平。p-p65 是p65活化的指標(biāo)，并作為NF-κB信號通路的主要轉(zhuǎn)錄因子。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，響應(yīng)Cav1過表達(dá)，p65在細(xì)胞核中迅速積累。接下來進(jìn)一步證實(shí)Cav1在適度CTS表現(xiàn)出的抗炎效應(yīng)中的作用，RT-qPCR數(shù)據(jù)顯示，Cav1的過表達(dá)消除了5% CTS誘導(dǎo)的抗炎作用，并導(dǎo)致促炎基因的上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，Cav1可能是一個(gè)關(guān)鍵的力學(xué)敏感因子，它通過調(diào)節(jié)p65核易位和下游炎癥信號來調(diào)節(jié)CTS處理的AFCs的炎癥反應(yīng)。

Cav1直接與整合素β1相互作用

先前的研究表明，Cav1和整合素β1之間的相互調(diào)控依賴于不同的基質(zhì)剛度的變化。基于上述結(jié)果，研究人員假設(shè)Cav1可能在外部力學(xué)線索誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)期間連接整合素β1。為了驗(yàn)證假設(shè)，首先應(yīng)用免疫熒光染色來追蹤兩種蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染pEX4-Cav1和pcDNA3.1-整合素β1質(zhì)粒的AFCs中的位置。在該實(shí)驗(yàn)中，Cav1和整合素β1在AFCs的細(xì)胞質(zhì)中共定位（圖4 A）。然后，用pEX4-Cav1或pcDNA3.1-整合素β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AFCs，以誘導(dǎo)Cav1或整合素β1過表達(dá)。蛋白質(zhì)印跡測定顯示，分別轉(zhuǎn)染pEX4-Cav1或pcDNA3.1-整合素β1質(zhì)粒的AFCs中整合素β1或Cav1蛋白水平顯著上調(diào)。根據(jù)上述結(jié)果，預(yù)測這兩種力學(xué)敏感蛋白之間存在一定的關(guān)系。

為了確定Cav1和整合素β1是否直接相互作用，用pEX4-Cav1或pcDNA3.1-整合素β1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AFCs，然后進(jìn)行免疫共沉淀（Co-IP）以驗(yàn)證它們的關(guān)系。事實(shí)上，整合素β1被抗-Cav1抗體沉淀（圖4 B），而Cav1也可能被抗-整合素β1抗體沉淀（圖4 C）。然而，p65不能被Cav1或整合素β1抗體沉淀，這表明p65核易位受上述力學(xué)敏感蛋白間接調(diào)控的。這些結(jié)果支持，Cav1和整合素β1可以直接相互作用，這兩種蛋白質(zhì)可能在外部力學(xué)線索誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮協(xié)同作用。

圖4 Cav1和整合素β1之間的相互作用。

（A）轉(zhuǎn)染有（過表達(dá)組）或不含（Ctrl組）pEX4-Cav1和pcDNA3.1-整合素β3質(zhì)粒的AFC中Cav1（紅色），整合素β1（綠色）和DAPI（藍(lán)色）的免疫熒光圖像。在轉(zhuǎn)染有pEX4-Cav1（B）或pcDNA3.1-整合素β1（C）質(zhì)粒的AFC中進(jìn)行共Co-IP 測定。

為了進(jìn)一步研究通過動態(tài)牽引力恢復(fù)退行性椎間盤的可行性，對輕度椎間盤退變大鼠（壓縮處理）的尾椎每隔一天用適度牽引力刺激2小時(shí)，持續(xù)2周。與假手術(shù)組相比，椎間盤高度和 NP 含水量降低。同時(shí)分析每組椎間盤的形態(tài)變化，AF的膠原纖維排列得波浪狀，更多的軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞出現(xiàn)在AF區(qū)域。2周后，NP含水量恢復(fù)，動態(tài)牽引力后椎間盤的典型形態(tài)恢復(fù)。總的來說，與釋放組的大鼠相比，牽引后的退行性椎間盤顯示出更好的恢復(fù)。

此外，進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色測定，以分析來自不同組的每個(gè)椎間盤AF中Cav1，p-p65，COX-2和膠原蛋白I的表達(dá)。數(shù)據(jù)表明，Cav1，p-p65和COX-2的表達(dá)在壓縮刺激的椎間盤中上調(diào)，但在適度牽引力刺激處理的椎間盤中顯著降低。然而，在適度機(jī)械刺激處理的椎間盤中，膠原蛋白I的表達(dá)呈相反趨勢，表達(dá)水平較高，代表退行性椎間盤的一種代償性修復(fù)。與體外結(jié)果一致，適度的機(jī)械刺激可能對退行性椎間盤的修復(fù)有益，這可能依賴于 Cav1 介導(dǎo)的信號通路。

圖5 總之，適度的力學(xué)刺激抑制了Cav1介導(dǎo)的信號通路，并對AFCs表現(xiàn)出抗炎作用。結(jié)合體內(nèi)結(jié)果，闡明了適度應(yīng)力刺激對椎間盤（IVD）影響的潛在分子機(jī)制，可為IVD退變的治療提供新的治療策略。

在這項(xiàng)研究中，通過體外和體內(nèi)模型研究了力學(xué)負(fù)荷在細(xì)胞和組織水平上對椎間盤的影響。研究發(fā)現(xiàn)過度的牽引力負(fù)荷（12% CTS）抑制了AFC的增殖和遷移，并增加了炎癥基因的表達(dá)水平。相反，適度機(jī)械負(fù)荷（5% CTS）通過抑制Cav1介導(dǎo)的整合素β1和NF-κB信號通路來挽救炎癥反應(yīng)并增強(qiáng)AFC增殖，遷移和ECM合成。此外，體內(nèi)結(jié)果表明，適度的力學(xué)刺激可以恢復(fù)NP的含水量，加速退行性椎間盤的重建。綜上所述，這項(xiàng)研究可能會促進(jìn)理解生理等效刺激對細(xì)胞的抗炎作用的進(jìn)展，并為DDD的物理療法的創(chuàng)新設(shè)計(jì)提供可能性。

參考文獻(xiàn)：Zhang W, Wang H, Yuan Z, Chu G, Sun H, Yu Z, Liang H, Liu T, Zhou F, Li B. Moderate mechanical stimulation rescues degenerative annulus fibrosus by suppressing caveolin-1 mediated pro-inflammatory signaling pathway. Int J Biol Sci. 2021 Apr 3;17(5):1395-1412. doi: 10.7150/ijbs.57774. PMID: 33867854; PMCID: PMC8040478.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33867854/

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