周細胞是類似于血管平滑肌細胞的一類細胞，因定位于毛細血管及微血管基膜周圍而得名。值得注意的是，周細胞的生物學行為依賴于內皮細胞（ECs）通過激活多種通路和釋放促血管生成因子（如PDGF-B、Ang-1/Ang-2/Tie2）施加的控制，這些因子在胚胎或病理血管生成中至關重要。此外，ECs和周細胞之間的相互作用不僅受到生化刺激的影響，還受到機械/物理因素的影響，包括血壓和流動依賴的剪切應力，這些因素也可能影響它們的串擾和細胞功能。事實上，流動依賴性剪切應力（FSS）在不同的病理狀況中起著關鍵作用，包括慢性肝病。FSS改變可能會影響間質微環境和歸巢細胞的生物學行為，導致炎癥過程和促纖維化轉變。這些變化可能相互支持。

人牙髓分離的周細胞樣細胞（hDPSCs）具有獨特的干細胞特性，賦予它們高增殖率、免疫調節特性和低免疫原性。研究證明，與預先激活的外周血單個核細胞（PBMCs）共培養的hDPSCs通過激活免疫檢查點（包括PD1 / PD-L1和Fas / FasL通路）以及調節主要參與炎癥反應的細胞因子的表達來發揮免疫調節/抗炎特性。

了解炎癥和干細胞之間的串擾引起了科學界的巨大興趣，因為它可能闡明干細胞響應組織損傷的激活機制以及如何塑造它們以保持組織穩態。基于這些前提，意大利摩德納雷焦艾米利亞大學醫學、牙科和形態學科學系的研究團隊為了更好地闡明周細胞在FSS誘導的病理狀況中的作用，使用了從人牙髓中分離的周細胞樣細胞群，評估了流動依賴性剪切應力如何影響 hDPSCs 的生物學特性，以預測它們在生理和病理生理條件下的潛在作用。

周細胞樣細胞的血管生成潛力

周細胞與血管生成密切相關，并參與血流動力學過程。此外，血管周圍的細胞表達PDGFR-β，這是一種典型的周細胞標志物。該研究的第一個目的是確認hDPSCs的血管生成能力。總體而言，在誘導內皮細胞分化期間，hDPSCs失去了其典型的成纖維細胞樣形態。在定型3天和5天后，細長的內皮細胞形態發生了明顯的變化。誘導7天后，細胞組裝成線狀血管（圖1 A）。鬼筆環肽染色進一步支持這些數據（圖1 B）。同時，對分化的hDPSCs的WB分析顯示，與未分化的hDPSCs相比，PDGFR-β表達在統計學上顯著降低。HUVEC細胞不表達PDGFR-β，證實其內皮表型（圖1 C）。免疫熒光圖像證實這一結果（圖1 D）。

Cleaved Caspase-3的蛋白質印跡分析顯示，內皮誘導不影響hDPSCs的細胞活力（圖1 E）。此外還研究了典型內皮標志物ANGPT1，Tie2，eNOS和VEGF的表達。WB分析顯示，eNOS和VEGF在內皮細胞分化過程中有統計學意義的上調，在作為陽性對照的HUVEC中達到相似的表達。關于Tie2受體的表達，僅在誘導7天時觀察到統計學上的顯著升高，而在其配體ANGPT1中沒有觀察到統計學上的顯著差異。值得注意的是，所有這些內皮標志物的基礎水平在未分化的hDPSCs中表達，表明它們具有血管生成潛力。為了評估hDPSCs形成管狀結構的能力，進行了功能測定。結果表明，在未分化的hDPSCs中也觀察到管狀血管網絡的形成。在誘導內皮分化后，hDPSCs的這種能力顯著增強。

圖1 hDPSCs的內皮分化。

流動剪切應力介導的效應分析

剪切應力作用于內皮細胞和/或周細胞，可在血管穩態和重塑以及病理生理學過程中起關鍵作用。許多細胞結構，包括代表暴露于外部刺激的第一層的細胞膜，通過調整其形狀來響應剪切應力。基于這一考慮，實驗接下來分析了流動剪切應力介導的效應。暴露于FSS（1.5 dyn/cm2）的hDPSCs重新排列了它們的形態（圖2 A）。因此，細胞顯得更加細長，失去了其典型的成纖維細胞樣形態（圖2 A，黑色箭頭）。為了排除FSS誘導干性表型改變的可能性，對在標準靜態條件下培養的hDPSCs和暴露于FSS（即動態條件）的hDPSCs進行了FACS分析。結果表明，FSS沒有改變兩個實驗組hDPSCs上典型MSCs標志物的表達。事實上，幾乎所有的hDPSCs對CD73、CD90和CD105呈陽性，而對CD34、CD45和HLA-DR呈陰性（圖2 B）。

圖2 單向脈動流動剪切應力對hDPSCs的影響。

在hDPSCs膜修飾反應的初始機械感應之后，可能發生了局部生化反應和下游細胞內信號通路的激活。因此，實驗評估了暴露于FSS的hDPSCs的不同激活通路。如圖3 A，熱圖和直方圖揭示了不同信號機制的激活情況。首先，FSS沒有誘導hDPSCs中的促凋亡信號通路。通過分析，發現是Akt/mTOR通路響應于脈動單向流動依賴性剪切應力而被激活。與靜態條件下的hDPSCs相比，動態條件下hDPSCs中Akt pS473的上調與mTOR pS2481顯著增加相關。同時，Akt pT308的磷酸化在兩個實驗條件下都沒有變化，PDK1 s241的磷酸化在暴露于FSS的hDPSCs中顯著降低。這些數據表明，Akt/mTOR通路的激活是由于hDPSCs膜變形和機械傳感激活的。此外，值得注意的是，FSS誘導PD-L1免疫調節標志物的顯著降低。同時，在動態條件下維持的hDPSCs顯示出NFkB pS536的強烈上調，同時IKBα pS32 36的顯著降低，據報道其磷酸化與NFkB失活有關。這些數據可能表明，脈動血流剪切應力調節hDPSCs的促炎命運。

有趣的是，FSS誘導eNOS pS117顯著下調，同時誘導eNOS pS113顯著上調。這些數據表明，在eNOS活性受到抑制同時，FSS也影響hDPSCs血管生成的潛在傾向。通過典型血管生成標志物（VEGF、ANGPT1 和 eNOS）的免疫熒光染色和管形成測定證實了這一數據。特別是假色分析顯示，暴露于動態培養條件的hDPSCs中VEGF，ANGPT1和eNOS的表達降低（圖3 B）。同時，與靜態培養條件下的hDPSCs相比，在動態條件下hDPSCs中管狀結構的數量在統計學上顯著減少（圖3 C），從而證實FSS也影響了hDPSCs形成管狀血管網絡的能力及其隨后的血管生成潛力。

圖3 FSS在hDPSCs中誘導的機械轉導。

hDPSCs對流動依賴性剪切應力下的免疫調節和炎癥反應

最后，實驗研究了動態流動條件對hDPSCs與預激活的CD3/CD28 hPBMCs之間共培養模擬的炎癥微環境的影響（圖4 A）。在與有或沒有FSS的PBMCs共培養后，由RPPA對hDPSCs進行生物學分析。之前已經確認了機械傳感轉導激活了Akt/mTOR通路。特別是，如圖4 A，直方圖顯示，與靜態條件下的hDPSCs相比，動態條件下hDPSCs中 Akt pS473的顯著增加與mTOR pS2481增加相關。此外，在兩種實驗條件下，Akt pT308的磷酸化均未檢測到統計學上的顯著差異，而在與暴露于FSS的PBMCs共培養后，PDK1 S241的磷酸化在hDPSCs中顯著降低。在該共培養系統中，暴露于FSS的hDPSCs的eNOS活性受到抑制，如eNOS pS117的顯著下調以及eNOS pS113的顯著上調（圖4 A）。隨后，還研究了與PBMCs共培養后暴露或不暴露于FSS的hDPSCs的免疫調節特性。與靜態條件下的hDPSCs相比，FSS的應用在動態條件下大大降低了hDPSCs中PD-L1的表達（圖4 A）。同時，在與PBMCs共培養后，動態條件下hDPSCs的NFkB pS536明顯增加，IKBα pS32 36顯著降低（圖4 A），表明促炎命運是由FSS驅動的。

為了確認hDPSCs在免疫調節中的可塑性，實驗評估了在靜態和動態條件下預激活的PBMCs與hDPSCs共培養后的細胞內炎性細胞因子。FACS分析表明，在靜態或動態共培養后，PBMCs中hDPSCs的污染最小且相當（圖4 B）。具體而言，與靜態條件下相比，FSS能夠誘導動態條件下單獨預激活的PBMCs中所有細胞因子的mRNA表達水平的上調。此外，在動態條件下進行hDPSCs共培養后，PBMCs中IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的mRNA表達水平顯著增加（圖4 C）。相反，與在靜態條件下單獨培養的PBMCs相比，在靜態條件下與hDPSCs共培養后，PBMCs中檢測到細胞因子水平（IFNγ，TNFα，IL-2，IL-10）的下調（圖4 C），除了IL-6在hDPSCs靜態條件共培養后上調（圖4 C）。這些數據表明，FSS對hDPSCs的促炎行為產生了強烈的影響。

圖4 炎癥微環境對暴露于FSS的hDPSCs的影響。

綜上所述，可以說機械力可能決定hDPSCs的生物學命運，hDPSCs可能在由炎癥微環境建立驅動的疾病發展過程中被激活，例如自身免疫性疾病和癌前病變。在這方面，已知間充質干細胞與免疫細胞具有活躍的相互作用，因此可能通過充當炎癥的傳感器和切換器來顯示抗炎和促炎作用。此外，該研究的數據為理解周細胞樣細胞和機械力在炎癥依賴性疾病的觸發和發展中的潛在作用提供了引導。

參考文獻：Bertani G, Di Tinco R, Bertoni L, Orlandi G, Pisciotta A, Rosa R, Rigamonti L, Signore M, Bertacchini J, Sena P, De Biasi S, Villa E, Carnevale G. Flow-dependent shear stress affects the biological properties of pericyte-like cells isolated from human dental pulp. Stem Cell Res Ther. 2023 Feb 18;14(1):31. doi: 10.1186/s13287-023-03254-2. PMID: 36805780; PMCID: PMC9938980.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36805780/

小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯系小編修正。
微信搜索公眾號“Naturethink”，了解更多細胞體外仿生培養技術及應用。