對于骨的形成和再生，提供氧氣和營養供應的充分的血管形成是必不可少的。改善骨組織工程應用中血管形成的策略包括使用血管生成生長因子、內皮細胞（ECs）和通過動靜脈袢進行手術誘導的血管生成。在許多研究中，ECs和間充質干細胞（MSCs）的共培養已被證明有利于增殖和成骨分化。在臨床實踐方面，從骨髓中分離出的MSCs 在數量和供體發病率方面可能受到限制。而來自脂肪組織的干細胞是骨髓間充質干細胞的有趣替代品。

以往的研究描述了分離、表征和多重分化潛力，并且已經表明脂肪來源的干細胞（ADSCs）也適用于動物的骨缺損愈合。此外，ADSCs在免疫調節能力和促血管生成因子和細胞外基質成分的分泌方面甚至優于MSCs，特別是在與內皮細胞的共培養中，ADSCs的成骨分化可以進一步增加。此外，人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）具有顯著的血管形成能力。ADSCs和HUVECs在組織工程應用中的共同應用似乎是增加血管形成和骨形成的有前途的方法。

基于此，德國埃爾朗根大學附屬醫院整形和手外科、輸血科的一項研究曾探索了二維細胞培養中HUVECs和成骨分化的ADSCs的最佳比例及其對增殖、細胞存活、成骨和血管生成的影響，為此，進行了ADSCs和HUVECs的共培養，比例為25%：75%，50%：50%和75%：25%。通過陰性免疫選擇，實驗試圖更詳細地揭示細胞類型對細胞凋亡，血管生成和成骨分化的特定影響。

細胞增殖

在第3、7和14天進行WST-8檢測測定細胞增殖。結果表明，14天后，所有組的活細胞數量均增加（圖1）。7天后，含有 75% 或 25% ADSCs的共培養組中活細胞的數量增加。14天后，與單一培養相比，能夠證明所有共培養組中有更多的活細胞。

圖1 與單培養相比，共培養ADSCs和HUVECs在7天和14天后增殖能力增強。

細胞凋亡

與HUVEC比例成正比，實驗檢測到ADSCs的凋亡率增加，其中75% ADSCs共培養組在7天和14天后的凋亡率最高（圖2 A）。相反，HUVECs在與ADSCs共培養時表現出單向減少的細胞凋亡。有趣的是，在ADSC比例≥50%的共培養中，細胞凋亡在第一周更明顯減少。2周后，無法檢測到ADSC比例對 HUVECs 細胞凋亡的任何顯著影響（圖2 B）。為了闡明其潛在的機制，進行了磷酸化-BAD蛋白（一種促凋亡蛋白）的ELISA，證實了磷酸化BAD的比例較低，這可能解釋了共培養ADSCs中較高的細胞凋亡率。另一方面，發現共培養的HUVECs中磷酸化BAD水平的升高導致細胞凋亡減少（圖2 C、D）。

圖2 共培養ADSCs和HUVECs降低了HUVECs的細胞凋亡，而ADSCs的凋亡增加了（A，B）。在共培養時，在ADSCs和HUVECs中評估磷酸化的蛋白BAD的量，表明共培養的HUVECs中磷酸化BAD量較高（C，D）。

成骨分化

通過茜素紅測定證明，共培養ADSCs和HUVECs增加了基質礦化。此外，共養組的基質礦化度隨著HUVEC比例的提高而增加。堿性磷酸酶（ALP）活性是成骨分化的另一個替代參數。在第3天，觀察到具有 HUVECs ≥25% 的共培養組中ALP活性的誘導。7天后，這種效應在所有共培養組中更加明顯。

在陰性免疫選擇和PCR之后，實驗能夠證明ALP基因表達的誘導僅限于ADSCs。此外，實驗還檢測到50% ADSCs共培養組中ALP mRNA水平最高（圖3 A）。此外，發現共培養后ADSCs中成骨轉錄因子RUNX2的水平增加。與 50% ADSCs共培養時，RUNX2表達上調幅度最大（圖3 B）。

圖3 陰性免疫分離后ALP和RUNX2基因表達的PCR分析。在含有50% ADSCs的共培養組中，ALP的表達顯著增加（A）。在共培養的ADSCs中也觀察到了RUNX2表達較高的趨勢（B）。

血管生成

為了研究ADSC / HUVEC共培養的血管生成潛力，進行了基質膠成管實驗。與成骨分化ADSCs相反，未分化的ADSCs在基質膠中形成管狀。在共培養中，管的數量和長度與HUVECs的數量成比例地增加（圖4 A‐H）。通過血管內皮生長因子（VEGF）的ELISA，能夠證明在單一培養條件下ADSCs在第3和第7天的VEGF產量最高。此外，在含有 ≥50% HUVECs的共培養中，VEGF的產生在第3天更加明顯。第7天共培養物之間無統計學差異（圖4 I）。內皮型一氧化氮合酶（eNOS）或基質金屬蛋白酶3（MMP3）等血管生成分子的基因表達在共培養的HUVECs中隨著ADSCs比例的增加而增加。

此外，共培養刺激ADSCs中內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、血管生成素2（Ang2）和血管內皮生長因子受體1（VEGF R1）的基因表達，而MMP3基因表達下調。

圖4 基質膠測定表明，管數（G）和總管長（H）隨著HUVEC比例的增加而增加。除此之外，未分化的ADSCs（F）形成管狀。VEGF ELISA檢測顯示在單培養條件下ADSCs中VEGF產量最高。

總之，該研究結果表明，在ADSCs和HUVECs的共培養中，增殖、成骨分化和促血管生成特征顯著增強，特別是當使用 50% ADSCs：50% HUVECs的細胞比例時。此外，HUVECs的細胞凋亡單向降低，這是由磷酸化-BAD依賴性機制介導的。在骨組織工程方面，有必要進行進一步的體內研究來研究這些有前景的體外效應。

參考文獻：Mutschall H, Winkler S, Weisbach V, Arkudas A, Horch RE, Steiner D. Bone tissue engineering using adipose-derived stem cells and endothelial cells: Effects of the cell ratio. J Cell Mol Med. 2020 Jun;24(12):7034-7043. doi: 10.1111/jcmm.15374. Epub 2020 May 12. PMID: 32394620; PMCID: PMC7299704.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32394620/

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