正畸牙齒移動（OTM）是一個機械力誘導(dǎo)牙周組織改建的過程。壓力側(cè)的牙槽骨吸收和張力側(cè)新骨再生的平衡決定了 OTM 的速度。一氧化氮（NO）已被證明對骨代謝有影響。NO 供體對成骨細(xì)胞的生長和骨形成具有有益的影響。同時，它們會降低破骨細(xì)胞的活性。研究指出，牙周組織在正畸力的作用下產(chǎn)生 NO。NO 的前體（L-精氨酸）加速了大鼠的 OTM，增加了壓力側(cè)破骨細(xì)胞的數(shù)量和Howship腔隙，而抑制 NO 產(chǎn)生的 NOS（一氧化氮合酶）抑制劑會減少 OTM。因此，NO 也對 OTM 產(chǎn)生了重大影響。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種 NOS 亞型：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。已經(jīng)證明，eNOS 介導(dǎo)張力側(cè)的骨形成，而 iNOS 介導(dǎo)壓力側(cè)的骨吸收。eNOS 和 iNOS 似乎是 OTM 過程中骨重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們主要分布在骨細(xì)胞中。與骨細(xì)胞不同，牙周膜細(xì)胞在早期 OTM 階段更傾向于成為機械傳感器，與 NO 信號傳導(dǎo)有關(guān)。人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），對維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。先前的證據(jù)表明，hPDLSCs 參與 OTM 過程。循環(huán)拉伸力（CTF）促進 hPDLSCs 中成骨基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，如堿性磷酸酶、RUNX2、osterix 蛋白和骨橋蛋白。此外，機械應(yīng)變可以刺激 hPDLSCs 分化成成骨細(xì)胞。

在首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)教研室及全牙再生與口腔組織功能重建實驗室小組的一項研究中報道了 hPDLSCs 可以產(chǎn)生 NO，NO 具有促進 PDLSCs 成骨分化的能力。在這項研究中，重點研究了模擬 OTM 的過程的機械拉伸力對 hPDLSCs 產(chǎn)生 NO 變化的影響，還發(fā)現(xiàn)了骨代謝的變化以及這一過程中涉及的潛在信號通路。

正畸力誘導(dǎo)體內(nèi) NO 產(chǎn)生和 NOS 表達(dá)

為了研究體內(nèi) OTM 過程中 NO 的產(chǎn)生，使用小鼠正畸力（30g）模型進行研究（圖1 a）。施加力7天后，OTM 的 HE 和顯微 CT 分析顯示，第一磨牙向內(nèi)側(cè)移動。觀察到遠(yuǎn)端牙周膜變寬，而近中端牙周膜受壓（圖1 b-d）。與對照組相比，NO2- 濃度在施加正畸力的小鼠血清中升高（圖1 e）。

圖1 正畸力誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和NOS表達(dá)。

力誘導(dǎo)的 NO 調(diào)節(jié) OTM 過程和骨形成

為研究力誘導(dǎo)的 NO 產(chǎn)生對 OTM 過程的影響，注射 NOS 抑制劑 L-NMMA 抑制其生成，并注射 NO 前體 L-精氨酸以增加 OTM 過程中的內(nèi)源性 NO 生成（圖1 f-g）。施加力7天后，測量上頜第一磨牙和第二磨牙之間的距離。與對照組相比，L-NMMA 對 NOS 的抑制作用縮短了 OTM 的距離。同時，注射L-精氨酸上調(diào)了 NO 水平并增加 OTM 的距離。

免疫組織化學(xué)染色顯示，與 PBS 對照組相比，在 OTM 期間阻斷內(nèi)源性 NO 的產(chǎn)生可抑制張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性 hPDLSCs 和骨細(xì)胞的積累（圖2 a、b、d）。為了進一步確認(rèn) NO 在 OTM 中的功能，注射了 L-精氨酸以提高小鼠的 NO 水平。結(jié)果顯示，與 PBS 對照組相比，張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽性 hPDLSCs 和骨細(xì)胞的積累增加（圖2 a、c、d）。

圖2 在OTM期間，力誘導(dǎo)的NO可以調(diào)節(jié)張力側(cè)的骨形成活動。
（a-c）遠(yuǎn)端張力側(cè)的代表性免疫組織化學(xué)圖像。（b、d）L-NMMA注射顯著抑制牙周膜堿性表達(dá)，促進堿性磷酸酶的表達(dá)。

循環(huán)拉伸力在體外誘導(dǎo) NO 生成和 NOS 表達(dá)

接下來，實驗研究了 hPDLSCs 的 NO 產(chǎn)生，這在 OTM 的骨形成過程中非常重要。此外，通過免疫染色評估發(fā)現(xiàn)人 hPDLSCs 表達(dá) eNOS 和 iNOS。為了研究 NO 產(chǎn)生的機制，對 hPDLSCs 施加循環(huán)拉伸力（10%伸長率，0.5 Hz，6、12、24 h），以在體外探索機械力對 NO 產(chǎn)生的影響。已經(jīng)證明，hPDLSCs 在沒有力刺激的情況下產(chǎn)生 NO。檢測 hPDLSCs 的培養(yǎng)上清液中 NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12小時和24小時后顯著增加（圖3 a）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，eNOS 和 iNOS 蛋白表達(dá)上調(diào)，qPCR 結(jié)果顯示相同的趨勢（圖3 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，施加 CTF 在 hPDLSCs 中促進 NO 生成，這可能對生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。

圖3 循環(huán)拉力誘導(dǎo)NO產(chǎn)生和NOS表達(dá)來調(diào)節(jié)hPDLSC的成骨。

力誘導(dǎo)的 NO 可能會調(diào)節(jié) OTM 期間張力側(cè)的骨形成

實驗假設(shè) OTM 期間張力側(cè)的骨形成可能是力誘導(dǎo)的 NO 通過 hPDLSCs 的成骨分化調(diào)控的。先前的研究表明，循環(huán)拉伸力促進了 hPDLSCs 的成骨分化。實驗用 CTF 處理 hPDLSCs 持續(xù)0小時，6小時，12小時和24小時，qPCR 檢測到 RUNX2，Osterix 和骨橋蛋白 mRNA 水平升高（圖3 d）。RUNX2 的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示出相同的趨勢（圖3 e）。

為了研究不同濃度的 NO 對成骨的影響，用 L-NMMA 處理 hPDLSCs 以降低 NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)拉伸力下，外源 NO 供體硝普鈉（SNP）增加 NO2- 的濃度（圖3 f）。qPCR 結(jié)果顯示，在 CTF 期間 NO 產(chǎn)生受到抑制時，RUNX2、Osterix 和骨橋蛋白 mRNA 表達(dá)降低，而在 CTF 期間促進 NO 生成時，它們的表達(dá)增加（圖3 g）。RUNX2 的蛋白質(zhì)印跡顯示出相同的趨勢（圖3 h）。

hPDLSCs 中的力誘導(dǎo)的 NO 可能調(diào)控 PI3K/Akt 信號通路

為了研究力誘導(dǎo)的 NO 如何影響 hPDLSCs 的成骨，實驗分析了 NO 下游通路 PI3K/Akt。刺激 hPDLSCs 后，p-PI3K、p-Akt 和活性 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)（圖4 a）。然后，用 PI3K 抑制劑 LY294002 處理 hPDLSCs，發(fā)現(xiàn) p-PI3K、p-Akt 和活性 β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（圖4 b）。此外，用 NO 抑制劑 L-NMMA 處理 hPDLSCs，發(fā)現(xiàn) L-NMMA 抑制了 CTF 處理下 hPDLSCs 中 PI3K/Akt 通路的促進（圖4 c）。

圖4 PDLSCs中力誘導(dǎo)NO可以通過PI3K / Akt信號通路由iNOS調(diào)節(jié)。

由于 NO 在 OTM 中的功能作用尚未完全闡明，該研究證明，力誘導(dǎo)的內(nèi)源性 NO 促進 PDLSCs 的成骨活性，有助于維持 OTM 期間牙槽骨的穩(wěn)態(tài)。NO 是調(diào)節(jié) OTM 過程所必需的，NO 水平的降低導(dǎo)致 OTM 距離縮短。隨著對 NO 在 OTM 中的作用的認(rèn)識的加深，可能會帶來一種基于 NO 供體的 OTM 的加速治療方法。

參考文獻(xiàn)：Sun Y, Fu J, Lin F, Li S, Du J, Liu Y, Bai Y. Force-Induced Nitric Oxide Promotes Osteogenic Activity during Orthodontic Tooth Movement in Mice. Stem Cells Int. 2022 Sep 6;2022:4775445. doi: 10.1155/2022/4775445. PMID: 36110889; PMCID: PMC9470363.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36110889/

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