血管平滑肌細胞（VSMCs）的遷移、增殖、凋亡和肥大異常變化是心血管疾病發病機制和病理的共同特征，并伴有細胞表型、形態和結構的變化，進而導致血運重建。因此，對VSMCs表型調控的研究對于闡明心血管疾病的發展和治療至關重要。

已發現生物力學因素對血運重建的發生和發展有直接和顯著的影響。許多研究證實，循環拉伸應變（CTS）可引起血管壁結構的變化，并能調節血管細胞的增殖、凋亡和遷移，從而對細胞外基質的合成、降解和重組產生重要影響。血管中膜的VSMCs在CTS下起著非常重要的作用，可以響應CTS刺激而改變細胞功能。

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼單鏈RNA，長約20-24個核苷酸，可參與基因表達的轉錄后水平調控。越來越多的證據表明，miRNAs在調節VSMC生物行為中起著重要作用。例如，miR-145 被證明是 VSMC 分化和表型轉變的主要決定因素，并且在動脈粥樣硬化和動脈損傷模型中均下調。以前的研究還表明，CTS通過調節細胞miRNAs的表達參與各種進展過程。例如，CTS 通過miRNA-27a促進骨髓間充質干細胞分化為心肌細胞樣細胞。然而，miRNAs 在CTS調控VSMCs生物學行為中的作用仍有待研究。

在昆明醫科大學第一附屬醫院眼科、血管外科課題組的一項研究中，首次通過SmallRNA-seq闡明了人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）響應CTS下差異表達的miRNAs。此外，選擇miR-187-3p進行體外驗證對CTS的反應以及對HASMCs表型的影響。研究結果將為CTS 在心血管疾病中的應用提供效應靶點和治療思路。

實驗首先闡明CTS對HASMCs增殖、凋亡和遷移的影響，以1 Hz的頻率，10% 和15% 的振幅分別處理HASMCs，持續24 h。MTT結果證實，與NC組相比，5%、10% 和 15% CTS組HASMCs增殖顯著增加，HASMCs增殖隨CTS振幅的增強而逐漸增加（圖1 a）。流式細胞術結果顯示，與NC組相比，CTS處理的HASMCs細胞凋亡水平明顯降低，HASMCs凋亡隨CTS振幅的增強而逐漸降低（圖1 b）。Transwell遷移結果表明，與NC組相比，CTS能夠增加Transwell下腔室HASMCs的數量（圖1 c）。此外，細胞凋亡相關蛋白和遷移相關蛋白的檢測結果表明，在CTS處理的HASMCs中，Bax、Caspase 3、MMP2和MMP 9的表達顯著增強，Bcl 2的表達顯著降低（圖1 d-e）。這些結果表明，CTS促進了HASMCs的增殖和遷移，抑制了其凋亡，并且該效應顯示了對CTS振幅的依賴性。

圖1 CTS對HASMCs生物學行為的影響。

為了探索CTS對HASMCs中miRNA表達譜的影響，實驗從CTS處理的HASMCs中提取了mRNA，用于SmallRNA-seq，設定的閾值為 log2FC≥ 1和P < 0.05。與NC組相比，在5%，10% 和15% 的CTS處理的HASMCs中分別有55個（31個上調，24個下調），16個（7個上調，9個下調）和16個（7個上調，9個下調）DE-miRNAs（圖2 a-f）。此外，miR-26a-2-3p和miR-187-3p在CTS處理的HASMCs中均顯著高表達（圖2 g）。研究表明，miR-26a-2-3p和miR-187-3p最有可能是CTS調控 HASMCs 的關鍵因子，miR-187-3p有531個下游靶點，miR-187-3p有3224個下游靶點，有189 個共同靶點mRNAs（圖2 h）。

圖2 HASMCs中差異表達的miRNAs對CTS的響應。

為了確定下游靶點的功能和涉及的通路，實驗進行了GO和KEGG通路富集分析Metascape。GO富集結果包括了183個生物過程、20個細胞成分和48個分子功能，主要包括“基底外側質膜”，“內吞循環”，“橫紋肌組織發育”，“內吞作用的調節”，“細胞對生長因子刺激的反應”和“蛋白質定位到內體”。KEGG富集顯示，189個靶基因富集為總共8個KEGG通路，包括“內吞作用”、“動物細胞自噬信號通路”、“HIF-1信號通路”、“癌癥的中樞碳代謝”、“溶酶體”、“丙型肝炎”、“調節干細胞多能性的信號通路”和“小細胞肺癌”。這些結果表明，CTS可以調節細胞增殖，凋亡和遷移。

為了闡明靶基因之間的相互作用，實驗利用Metascape進一步構建了189個靶基因的PPI網絡，并應用MCODE算法識別PPI網絡中的蛋白質緊密連接，以進行聚類構建功能模塊（MCODE），其中三個MCODE從PPI網絡中鑒定出來。結果表明，MCODE_1 PPI網絡蛋白主要富集于網格蛋白有被小窩、運貨受體活性和受體介導的內吞作用；MCODE_2 PPI網絡蛋白主要富集于調節翻譯、DNA修復和細胞酰胺代謝過程調控；MCODE_3 PPI網絡蛋白主要富集于肌節、肌原纖維和收縮纖維。

研究人員進一步驗證了miR-26a-2-3p和miR-187-3p在CTS調控HASMCs生物學行為中的作用。RT-qPCR結果顯示，CTS顯著提高了miR-26a-2-3p和miR-187-3p在HASMCs中的表達水平，miR-187-3p的表達水平高于miR-26a-2-3p（圖3 a）。因此，選擇了miR-187-3p進行后續驗證。

應用MiR-187-3p模擬物和miR-187-3p抑制劑調節miR-187-3p的表達水平。結果表明，轉染miR-187-3p模擬物后miR-187-3p的表達顯著增加（圖3 b），并在轉染miR-187-3p抑制劑后降低（圖3 c）。MTT結果表明，過表達miR-187-3p增強了15% CTS對HASMCs的增殖促進作用，而敲低miR-187-3p產生了相反的效果（圖3 d）。流式細胞術結果顯示，與15% CTS處理的HASMCs相比，轉染miR-3-187p模擬物的HASMC凋亡顯著降低，轉染miR-3-15p抑制劑的HASMCs細胞凋亡顯著增加（圖3 e）。Transwell結果顯示，miR-187-3p模擬組HASMCs遷移數量顯著高于15% 組，而miR-187-3p抑制劑組顯著低于15% 組（圖3 F）。與15% CTS組相比，過表達miR-187-3p顯著下調Bax和Caspase 3 表達，顯著上調Bcl2、MMP2和MMP 9表達，而敲低miR-187-3p產生相反的效果（圖3 g-h）。這些結果表明，CTS通過上調miR-187-3p的表達來刺激HASMCs的增殖和遷移并抑制其凋亡。

圖3 CTS通過miR-187-3p對HASMCs生物行為的影響。

綜上所述，該研究闡明了CTS促進HASMCs的增殖和遷移并抑制細胞凋亡，并揭示了HASMCs中通過RNA-seq響應CTS的miRNAs。這表明miR-187-3p可能是CTS導致血運重建的重要靶標。這些結果豐富了生物力學對血運重建的作用機制。但是缺乏體內實驗來驗證這項研究中的發現，miR-187-3p調控HASMCs表型的分子生物學機制仍有待進一步研究。

參考文獻：Yang D, Wei GY, Li M, Peng MS, Sun Y, Zhang YL, Lu C, Qing KX, Cai HB. Cyclic tensile strain facilitates proliferation and migration of human aortic smooth muscle cells and reduces their apoptosis via miRNA-187-3p. Bioengineered. 2021 Dec;12(2):11439-11450. doi: 10.1080/21655979.2021.2009321. PMID: 34895047; PMCID: PMC8810176.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34895047/

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