研究表明，由于過度的壓力負(fù)荷，椎間盤細(xì)胞的凋亡減少了椎間盤中活性細(xì)胞的數(shù)量，從而減少了細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成并改變了其組成，這是IVDD的重要病因。此外，發(fā)現(xiàn)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路參與了循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的大鼠纖維環(huán)細(xì)胞（AF）細(xì)胞凋亡，然而，抑制這兩種通路并不能完全阻止細(xì)胞凋亡。這表明循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的椎間盤細(xì)胞凋亡的機(jī)制的復(fù)雜性。

ROS和氧化應(yīng)激主要通過調(diào)節(jié)核因子κβ（NF-κB）通路、絲裂原活化蛋白激酶通路和磷脂酰肌醇3激酶通路，對(duì)各種骨骼和肌肉疾病產(chǎn)生致病作用。正常椎間盤組織的特征是缺乏血管引起的缺氧微環(huán)境。之前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為與IVDD無關(guān)。然而，最近的多項(xiàng)研究證實(shí)，椎間盤細(xì)胞在椎間盤微環(huán)境中代謝體內(nèi)氧氣并產(chǎn)生ROS，從而作為調(diào)節(jié)ECM代謝、促炎因子表型、細(xì)胞凋亡、自噬和衰老的重要介質(zhì)。

柚皮苷又稱柚苷、柑橘苷，是一種天然的黃酮類化合物，具有多種生物學(xué)作用，包括抗氧化、血管生成和抗炎等。柚皮苷的保護(hù)作用主要通過調(diào)節(jié)各種器官中的各種酶促和非酶促抗氧化參數(shù)（增加GSH，GPx，SOD和CAT以及降低MDA）介導(dǎo)的。骨碎補(bǔ)（Rhizoma Drynariae）是一種傳統(tǒng)中藥，在中國(guó)通常用于治療退行性椎間盤疾病和骨質(zhì)疏松癥，然而，其作用機(jī)制仍不清楚。研究表明，柚皮苷可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)椎間盤ECM代謝，延緩IVDD。此外，已證實(shí)柚皮苷可以抑制疼痛介質(zhì)的釋放，緩解椎間盤性腰痛，并抑制IVDD。因此，柚皮苷可能是治療IVDD相關(guān)疾病的合適候選者。然而，柚皮苷對(duì)循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的椎間盤細(xì)胞凋亡的影響尚不清楚。

基于此，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院脊柱中心、附屬仁濟(jì)醫(yī)院中醫(yī)科以及揚(yáng)中市中醫(yī)院骨傷科的研究團(tuán)隊(duì)曾探討了柚皮苷對(duì)循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和IVDD的影響及其體外和體內(nèi)機(jī)制，為柚皮苷在IVDD治療中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

柚皮苷改善循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的大鼠 AF 細(xì)胞凋亡

將大鼠AF細(xì)胞置于循環(huán)拉伸（0.5?Hz，20%）下36 h，體外實(shí)驗(yàn)組如下：對(duì)照組-靜態(tài)細(xì)胞；拉伸組-未經(jīng)柚皮苷處理（0 μg/mL）拉伸的細(xì)胞；柚皮苷處理組-以低（50 μg/mL）或高（100 μg/mL）濃度柚皮苷處理的拉伸細(xì)胞。拉伸36 h后，細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出凋亡形態(tài)，用高濃度和低濃度柚皮苷處理可抑制這些作用。Hoechst 33258染色顯示染色質(zhì)固縮和核分裂顯著增加，柚皮苷可有效抑制。流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步顯示，對(duì)照組大鼠AF細(xì)胞凋亡率僅為2.3±0.8%，而拉伸組凋亡率提高至34.1±1.6%。此外，與拉伸組相比，柚皮苷高、低濃度組的細(xì)胞凋亡率顯著降低。

柚皮苷抑制大鼠 AF 細(xì)胞中循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 Caspase-3 和 Caspase-9 的活化

循環(huán)拉伸36 h后，拉伸組cleaved caspase-3 （活化形式）和caspase-9 水平顯著升高。相比之下，與拉伸組相比，柚皮苷高、低濃度組的cleaved caspase-3 和caspase-9 水平受到顯著抑制。

柚皮苷抑制循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化和細(xì)胞色素C 釋放

循環(huán)拉伸36 h后，可以發(fā)現(xiàn)其抑制了線粒體膜電位。與拉伸組相比，柚皮苷高、低濃度組線粒體膜電位顯著增加，但未達(dá)到對(duì)照組水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮苷抑制了AF細(xì)胞中循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的線粒體膜電位去極化（圖1 a、b）。此外，循環(huán)拉伸36 h后細(xì)胞色素C的胞質(zhì)水平顯著增加，但柚皮苷顯著抑制了柚皮苷高、低濃度組細(xì)胞色素C向細(xì)胞質(zhì)中的釋放（圖1 c、d）。

圖1 柚皮苷對(duì)周期性拉伸誘導(dǎo)線粒體損傷的影響。

（a）循環(huán)拉伸36小時(shí)后用JC-1染色的細(xì)胞的代表性圖像。（b）紅綠熒光強(qiáng)度比值用于測(cè)定線粒體膜電位并進(jìn)行半定量分析。（c）用于檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C的代表性蛋白質(zhì)印跡。（d）細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞色素C水平的半定量分析，和拉伸組比較。

柚皮苷抑制循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

與對(duì)照組相比，拉伸組ROS和MDA水平顯著升高，SOD和GPx水平顯著降低。與拉伸組相比，高、低濃度柚皮苷處理組ROS和MDA水平顯著下降，SOD和GPx水平顯著升高。這些結(jié)果表明，柚皮苷可以抑制AF細(xì)胞中循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

柚皮苷抑制循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 NF-κB 信號(hào)通路的激活

與對(duì)照組相比，拉伸組p-Iκ Bα和p-P65的表達(dá)顯著增加。與拉伸組相比，高、低濃度柚皮苷處理組p-IκBα和p-P65蛋白表達(dá)顯著下降。此外，兩組間總P65表達(dá)未見顯著變化。這些結(jié)果表明，柚皮苷抑制了循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的 IκBα/NF-κB通路的活化（圖2 a、b）。

圖2 柚皮苷對(duì)NF-κB通路標(biāo)志物（蛋白質(zhì)）水平的影響。

（a）代表性蛋白質(zhì)印跡，顯示柚皮苷對(duì)循環(huán)拉伸暴露 36 小時(shí)后 p-IκBα、p-P65 和 P36 蛋白表達(dá)的影響。（b）p-IκBα、p-P65 和 P65 表達(dá)的半定量分析。

柚皮苷延緩椎間盤退變

MRI 顯示假手術(shù)組椎間盤正常。3個(gè)月后，高濃度和低濃度柚皮處理組的椎間盤MRI顯示出比IVDD組更強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度，IVDD組顯示信號(hào)較弱。此外，使用Pfirrmann等級(jí)評(píng)估椎間盤退變程度，與IVDD組相比，高濃度和低濃度柚皮苷治療組的椎間盤退變程度顯著降低（更好），盡管兩個(gè)處理組之間沒有觀察到顯著差異。

柚皮苷略微降低 IVDD 分級(jí)

3個(gè)月后，對(duì)照組的椎間盤呈現(xiàn)正常或輕度蛇紋石外觀，而IVDD組和兩個(gè)柚皮苷處理組的椎間盤顯示輕度至中度蛇紋石外觀，輪廓反轉(zhuǎn)，破裂或結(jié)構(gòu)模糊。同時(shí)，與IVDD組相比，高濃度和低濃度柚皮苷處理組的退變程度略有下降，但差異不顯著。

柚皮苷抑制 AF 細(xì)胞原位凋亡

在處理后3個(gè)月，與其他三組相比，對(duì)照大鼠的椎間盤內(nèi)可見的凋亡細(xì)胞較少。同時(shí)，高濃度和低濃度柚皮苷處理組的細(xì)胞凋亡率顯著低于IVDD組。

柚皮苷可抑制I型膠原蛋白和MMP-3原位表達(dá)的增加

I型膠原表達(dá)的增加是IVDD的指標(biāo)。免疫組織化學(xué)顯示，IVDD組I型膠原染色率高于假手術(shù)組。I型膠原蛋白在高、低濃度柚皮苷處理組中的表達(dá)低于IVDD組。作為一種分解代謝酶，MMP-3表現(xiàn)出與I型膠原蛋白相似的表達(dá)趨勢(shì)。

柚皮苷抑制 IVDD 大鼠血清和椎間盤組織中的氧化應(yīng)激

與假手術(shù)組相比，高、低濃度柚皮苷處理組血清和椎間盤中ROS和MDA水平升高，SOD和GPx活性顯著降低。然而，與IVDD組相比，高、低濃度柚皮苷處理組的ROS和MDA水平顯著下降，SOD和GPx活性顯著增加。這些結(jié)果表明，柚皮苷可以降低大鼠靜態(tài)和動(dòng)態(tài)不平衡引起的氧化應(yīng)激水平（圖3 a、d）。

圖3 柚皮苷對(duì)動(dòng)態(tài)和靜態(tài)力不平衡誘導(dǎo)的大鼠腰椎間盤退變（IVDD）氧化應(yīng)激和p-P65表達(dá)的影響。

（a-d）柚皮苷對(duì)血清和椎間盤組織中氧化應(yīng)激的影響：（a）活性氧（ROS）產(chǎn)生，（b）丙二醛（MDA），（c）超氧化物歧化酶（SOD）和（d）谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）水平。（e）柚皮苷對(duì)椎間盤p-P65表達(dá)的影響。p-P65在高濃度和低濃度柚皮苷處理組中的表達(dá)低于IVDD組。

柚皮苷抑制 p-p65 原位表達(dá)

免疫組織化學(xué)顯示，p-P65在高濃度和低濃度柚皮苷處理組中的表達(dá)顯著低于IVDD組。然而，兩個(gè)組之間沒有觀察到顯著差異（圖3 e）。

綜上所述，該研究表明柚皮苷可以通過抑制氧化應(yīng)激和NF-κB信號(hào)通路的激活來減少循環(huán)拉伸誘導(dǎo)的AF細(xì)胞凋亡并延緩IVDD。因此，它可以作為IVDD的潛在治療藥物。然而，由于柚皮苷具有多種藥理學(xué)特性，因此在臨床應(yīng)用之前應(yīng)探索其對(duì)其他組織和器官的全身作用。

參考文獻(xiàn)：Zhang YH, Shangguan WJ, Zhao ZJ, Zhou FC, Liu HT, Liang ZH, Song J, Shao J. Naringin Inhibits Apoptosis Induced by Cyclic Stretch in Rat Annular Cells and Partially Attenuates Disc Degeneration by Inhibiting the ROS/NF-κB Pathway. Oxid Med Cell Longev. 2022 Feb 23;2022:6179444. doi: 10.1155/2022/6179444. PMID: 35251479; PMCID: PMC8890877.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35251479/

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