慢性粒細胞白血病（CML）是一種骨髓增殖性疾病，表現為成熟和未成熟的粒細胞不受調控的異常增殖，導致外周血白細胞大量增生。CML起源于白血病干細胞（LSC，CD34+CD38-lin-cells）群體。LSCs存在于骨髓微環境（BMM）中，與正常的造血干細胞（HSCs）共存。在疾病進展過程中，HSCs被LSCs及其子代取代。研究已經表明，白血病細胞會改變其周圍的生態位，例如，通過誘導促炎環境，為LSC的自我更新、分化和存活創造寬松的空間。

血管微環境已被確定為CML發展的重要因素。在小鼠模型中觀察到，惡性腫瘤建立后骨髓（BM）中血管化增加，在CML患者的BM 中同樣，這提示其與預后不良有關。據報道，在CML小鼠模型中，BM內皮細胞可以調節白血病干細胞和祖細胞的靜息和增殖。然而，這一觀察結果尚未在原代人類細胞中得到評估。

在墨西哥國立自治大學、墨西哥塞古羅社會研究所的一項報告中，描述了原始白血病細胞與內皮集落形成細胞（ECFC）的共培養，作為白血病細胞與血管微環境相互作用的體外模型，以分析內皮細胞對維持CML患者干細胞和祖細胞的影響。

與內皮細胞共培養可維持原始 CML 細胞

基于血管微環境能夠調節小鼠惡性造血的事實，實驗建立了一個體外模型，其中人內皮細胞（EC）與富含干細胞和祖細胞（認為是原始細胞）的CML細胞群共培養。如圖1 a，CML細胞與EC的共培養對CML細胞有維持作用。在沒有EC（對照）的情況下沒有觀察到這種效果。值得注意的是，當在沒有內皮細胞但存在造血刺激因子（細胞因子對照）的情況下培養細胞時，CML細胞群的總數量翻了一番。

內皮細胞與CML細胞共培養，不接觸或接觸，都導致Lin-CD34+ CD38- 細胞水平分別比初始細胞數增加110%和170%（圖1 b）。后者與細胞因子對照中的增加相似。在對照培養（僅基礎培養基）中，Lin-CD34+ CD38- 細胞的數量減少（圖1 b）。在Lin-CD34+ CD38+ 細胞中，當它們與EC接觸時觀察到增加了 20%。這種增加在細胞因子對照培養中沒有發生，并且與陰性對照和無接觸共培養相比具有統計學意義，其中細胞群的總數量減少了一半（圖1 c）。

為了確定共培養對集落形成細胞（CFC）水平的影響，進行了集落測定。圖1 d顯示當白血病細胞與EC接觸時，CFC水平得以維持；相比之下，在無接觸共培養中，CFC水平降低了50%。在細胞因子對照和僅基礎培養基對照中，CFC數量分別減少了65%和83%（圖1 d）。此外，在無接觸共培養中，觀察到大多數集落對應于骨髓（CFU-G和CFU-M）和晚期紅系（CFU-E）集落，而在接觸共培養中，觀察到高比例的BFU-E，CFU GM和CFU-Mix集落，這表明直接接觸共培養有利于更原始祖細胞的存活。

為了鑒定可能參與培養中白血病細胞維持的可溶性因子，在培養3天后對上清液進行了多重分析。在無接觸共培養中，發現與骨髓分化相關的炎性細胞因子和可溶性分子的大量產生。另一方面，在直接接觸培養中，炎癥分子的分泌減少，僅觀察到高水平的IL-1a，IL-6和SCF（圖1 e）。值得注意的是，所有這些細胞因子都參與CML細胞維持。這些數據表明，與內皮細胞的接觸有利于維持培養中的CML原始細胞。

圖1 與內皮細胞共培養可維持CML原始細胞。

（A）在EC共培養三天后評估總CML細胞數。（B）共培養3天后評估干細胞（Lin-CD34+ CD38-）或（C）祖細胞（Lin-CD34 + CD38 +）細胞數。（D）共培養三天后，將3000個造血細胞在甲基纖維素中傳代培養14天，并評估CFC。（E）通過多重分析物測定進行細胞因子檢測。

白血病干細胞仍然附著在內皮細胞上

基于上述結果，表明內皮細胞和CML原始細胞之間直接接觸的重要性，因此接下來專注于直接接觸共培養。實驗觀察到，在共培養3天后，檢測到兩種不同的造血細胞：一部分由直接附著在內皮上的造血細胞（cc貼壁）組成，占總細胞的15.9%，第二部分留在共培養的上清液中（cc非貼壁），占細胞的84%（圖2 a、b）。有趣的是，這些比例在正常造血細胞的培養中有很大的不同（圖2 a），其中附著在內皮上的細胞數量較多（40.2%）。

當在每個共培養組中分析細胞免疫表型時，以不同的頻率檢測到干細胞、祖細胞和成熟細胞（圖2 c、d）。在貼壁部分中，16%，61% 和 22% 分別顯示干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型。在非貼壁部分中，具有干細胞，祖細胞和成熟細胞免疫表型的細胞百分比分別為9%，74% 和17%。值得注意的是，Lin-CD34+ CD38+ 細胞的增加與評估的CFC數量相關（圖2 e）。

考慮到CD26已被作為是 CML干細胞的特異性標志物，因此在共培養的總造血細胞以及直接接觸共培養物的貼壁和非貼壁組中評估了其表達。圖2 f顯示，在EC存在3天和6天后，lin-CD34+ CD38- CD26+ 細胞的水平分別增加50%和120%。與這一結果一致的是，3天后在附著和非附著到內皮的細胞中檢測到CD26的表達（圖2 g），而成熟細胞的數量（CD34- Lin+，圖2 d）和骨髓細胞（CD14+，圖2 h）細胞減少。

當使用MEG-01 CML細胞系（人成巨核細胞白血病細胞系）時，也觀察到了類似的結果。事實上，干細胞群優先富集貼壁部分（從0時的0.25% 到共培養3天后的1.34%）。這些結果表明，在培養系統中，分化和未分化的CML細胞可能對內皮細胞具有不同的親和力。

圖2 CML原始細胞對內皮微環境具有不同的親和力。

（A）CML和NBM接觸共培養中貼壁和非貼壁造血細胞的百分比。（B）與貼壁（右）和非貼壁（左）細胞組共培養的代表性照片。（C）代表性點圖和（D）在實驗開始（零時間）和三天后不接觸（對照）或存在EC時，分別分析貼壁和非貼壁部分部分的不同CML種群的百分比。（E）共培養三天后，將3000個造血細胞在甲基纖維素中傳代培養14天并評估CFC。（F）CML干細胞CD26+ 在共培養3天和6天后進行評估，以及（G）貼壁和非貼壁部分。（H）CD14+ 髓系細胞的百分比。

與EC共培養可調控CML LSC的增殖狀態

為了確定EC在CML增殖和干細胞免疫表型保留中的作用，在24、48和72 h用CFSE多重染色跟蹤CML 細胞（CD45+）和干細胞（CD34+ CD38-）群，并在EC存在下共培養3天后跟蹤原始免疫表型標記。

圖3表明，在MEG-01細胞系的總CML群中，保持附著在EC上的部分具有最高的增殖潛力（圖3 a，紅色直方圖），與細胞分裂指數的顯著增高相關（圖3 b）。在原代CML細胞總群中觀察到相同的結果（圖3 d，紅色直方圖和3 e），但在正常骨髓細胞中未檢測到，其中貼壁和非貼壁細胞顯示出相似的增殖，也具有相似的細胞分裂指數。

當跟蹤來自MEG-01細胞系（CD34+ CD38-）和一個CML原代樣品（lin-CD34+ CD38-）的干細胞群時，相對于非貼壁細胞，粘附在內皮層的部分觀察到更多的細胞分裂（圖3 a、d）。這種增殖能力比之前描述的CML細胞總數更明顯。與這一結果一致，MEG-01細胞的貼壁部分的細胞分裂指數高于非貼壁部分的干細胞（圖3 c）。此外，在保持粘附于EC上的CML原代細胞樣品中，具有干細胞和祖細胞免疫表型的細胞總數相對于CML對照中的初始數量增加了4倍和1.7倍（圖3 f、g）。這些結果表明，白血病干細胞具有在內皮微環境中保留和增殖的特殊能力，即使它們存在于貼壁部分中。

為了驗證與EC接觸的Lin-CD34+ CD38- 的增殖能力，在每次共培養結束時評估細胞周期狀態。結果表明，與EC接觸72 h后，G0期貼壁細胞數量相對于0時增加5倍，而S/G2/M期數量減少。相反，非貼壁部分的細胞增殖期（S/G2/M）增加（圖3 h、i）。這些結果與正常骨髓細胞的結果不同，其中靜息細胞群在共培養前后保持相似，表明這種行為是CML細胞獨有的，并且取決于細胞接觸。

有趣的是，G0 期粘附在EC上的細胞中有29.5% 顯示出干細胞表型，相比之下，非粘附部分中只有 2.7% 的G0細胞顯示出干細胞表型（圖3 j）。此外，在活躍的細胞周期階段（S/G2/M）未觀察到具有干細胞表型的細胞，其中最高百分比（90%）對應于祖細胞（圖3 j）。

這些結果表明，內皮微環境可以誘導CML干細胞的增殖和/或靜息，這可能與兩個細胞系之間建立的相互作用類型有關。

圖3 內皮微環境可以誘導CML干細胞的增殖和細胞周期停滯。

（A）來自MEG-01細胞系或（D）原代CML樣品的總或干細胞群中培養24，48和72小時的CFSE測定的代表性直方圖。MEG-01細胞系（B）群體和（C）干細胞群（CD38 + CD34-）在共培養24、48和72小時時的細胞分裂指數。（E）共培養3天后的原代CML總細胞。共培養72小時后具有（F）干細胞（Lin-CD34+ CD38-）和（G）祖細胞（Lin-CD34+ CD38 +）免疫表型的細胞數量。（H）在不同共培養條件3天后一個CML樣品的代表性點圖。（I）細胞周期階段的倍數變化。（J）每個共培養條件和細胞周期階段不同造血亞群的百分比。

與EC共培養后改變細胞因子譜和Notch 表達

為了解釋白血病細胞在內皮微環境中的持久性，在共培養3天后分析了它們的細胞因子譜。圖4 a表明，與對照（無接觸共培養）相比，可溶性因子（例如：IL-1a，IL-6和PIGF）顯著增加，這些因子與白血病有關，以犧牲正常的造血能力為代價。可能引發慢性炎癥并引起促白血病微環境的分子，如IL-8、TGF-b1、GM-CSF和MCP-1，也顯著升高。這種情況可能與觀察到的增殖有關，但不一定能解釋細胞的靜息。

考慮到在小鼠模型中粘附分子（如Notch1及其配體）參與CML干細胞和祖細胞的維持，因此實驗分析了共培養組、MEG-01細胞系和內皮細胞中Notch1、Jagged 2 和DLL4的表達。結果發現，共培養72小時后，白血病細胞和內皮細胞中Notch-1和 Jagged-2 表達增加（圖4 b）。該時間點（72小時）與細胞周期G0期白血病細胞停滯的時刻相關，盡管肯定還有其他分子參與其中，但這項研究的結果表明，在人類CML中，內皮微環境為維持白血病造血創造了合適的場所，并且干細胞的靜息和增殖，即使在粘附條件下，也可能與通過直接接觸和可溶性因子分泌物建立的通訊有關，這會導致白血病的持久性。

圖4 與EC共培養后的細胞因子譜和notch 表達。

（A）共培養3天后評估共培養上清液中的細胞因子濃度。（B）采用流式細胞術分析共培養24、48和72h后內皮細胞和MEG-01細胞系中Notch1、Jagged-2 和DLL4的表達。

總之，這項研究表明，原始CML細胞和正常內皮細胞之間的共培養，沒有任何額外因素的情況下，產生了一個微環境，通過它們的靜息狀態、增殖和分化，允許原始CML細胞在體外的維持，這似乎與炎癥環境的產生有關，以及它們自身的粘附能力，可能涉及 Notch1-Jagged2 軸。在這種情況下，有必要使用源自CML骨髓的內皮細胞來評估這些相同的生物效應，其中觀察到的效果可能更大，因為內皮細胞可能已經具有功能改變。

參考文獻：Torres-Barrera P, Moreno-Lorenzana D, Alvarado-Moreno JA, García-Ruiz E, Lagunas C, Mayani H, Chávez-González A. Cell Contact with Endothelial Cells Favors the In Vitro Maintenance of Human Chronic Myeloid Leukemia Stem and Progenitor Cells. Int J Mol Sci. 2022 Sep 7;23(18):10326. doi: 10.3390/ijms231810326. PMID: 36142235; PMCID: PMC9499491.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36142235/

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