間充質(zhì)干細胞（MSCs）已被應用于治療各種不治之癥，并且大量研究已經(jīng)探索了與其治療特性相關的旁分泌和抗炎作用。已知間充質(zhì)干細胞會遷移到受損組織或炎癥部位，在那里它們受到干擾素（IFN）-γ、TNF-α或白細胞介素（IL）-1β等炎性細胞因子的刺激，以表達各種免疫抑制因子，包括吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子（TNF）-α刺激基因-6（TSG-6）、一氧化氮（NO）、IL-6、IL-10等。巨噬細胞在炎癥部位分泌包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的各種炎性細胞因子，它們可以通過間充質(zhì)干細胞誘導TSG-6的表達。

TSG-6是一種與炎癥相關的多功能蛋白，具有抗炎和組織保護特性。此外，TSG-6在炎性細胞遷移、細胞增殖和發(fā)育過程中起重要作用。TSG-6可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞、中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞泡沫細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞的遷移和增殖來抑制炎癥反應。TSG-6可通過抑制TGF-β信號通路來調(diào)節(jié)成纖維細胞的生長，從而達到抗纖維化的效果。

暴露于炎癥環(huán)境的MSCs可以通過表達TSG-6來調(diào)節(jié)炎癥細胞的活性來再生受損組織。盡管包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的炎性細胞因子可以增加TSG-6表達，但對MSCs和巨噬細胞之間TSG-6表達的關系知之甚少。

基于此，韓國延世大學原州醫(yī)學院外科、內(nèi)科以及醫(yī)學研究中心的研究團隊假設在不同過渡狀態(tài)的巨噬細胞相關的間充質(zhì)干細胞中，TSG-6的表達可能存在差異。因此，在一項研究中，研究人員希望確定巨噬細胞的哪些轉(zhuǎn)移狀態(tài)可能參與脂肪干細胞（ASCs）中的TSG-6表達，哪些類型的細胞因子對TSG-6表達很重要，以及哪些信號通路可以調(diào)節(jié)TSG-6表達。為了探索這些問題，研究了TSG-6在ASCs和M0、M1和M2巨噬細胞間接共培養(yǎng)后的表達以及ASCs中TSG-6表達的最佳條件。此外，針對TSG-6的抗纖維化作用，研究了表達TSG-6的ASCs和巨噬細胞是否能夠緩解TGF-β誘導的肝星狀細胞纖維化。

與巨噬細胞共培養(yǎng)后 ASCs 中 TSG-6 mRNA 的表達增加

由于MSCs在炎癥環(huán)境中誘導TSG-6表達，因此研究了MSCs中的TSG-6表達是否因巨噬細胞的轉(zhuǎn)換狀態(tài)而不同。ASCs單獨培養(yǎng)或與巨噬細胞共培養(yǎng)，并分別用IFN-γ和LPS或IL-4和IL-13處理，它們分別促進巨噬細胞向M1或M2表型的轉(zhuǎn)變，然后分析TSG-6表達。結果表明，無論巨噬細胞轉(zhuǎn)化狀態(tài)如何，都會增加ASCs中的TSG-6表達。M0 和 M2 巨噬細胞分別使 TSG-6 表達增加了 5 倍和 15 倍，而 M1 巨噬細胞顯著增加了 ASCs 中的 TSG-6 表達約 62 倍（圖1）。這些結果表明，與巨噬細胞共培養(yǎng)增加了ASCs中TSG-6的表達，并且M1巨噬細胞或促炎性條件可能在ASCs的TSG-6表達中起特別重要的作用。

接下來，分析了巨噬細胞是否對ASCs中的TSG-6表達至關重要，以及TSG-6是否在巨噬細胞中表達。ASCs單獨培養(yǎng)或與巨噬細胞共培養(yǎng)，并用IFN-γ和LPS（促進M1表型的巨噬細胞轉(zhuǎn)化因子）處理。在用IFN-γ和LPS處理的ASCs中，TSG-6表達增加了約21倍，而與M0巨噬細胞共培養(yǎng)的ASCs中TSG-6表達增加了約10倍。有趣的是，當ASCs與M1巨噬細胞共培養(yǎng)時，ASCs和M1巨噬細胞中的TSG-6 mRNA分別增加了約63倍和46倍。此外，使用小鼠巨噬細胞Raw 264.7分析了巨噬細胞對ASCs中TSG-6 的表達是否是特異性所必需的。結果表明，與由 THP-1 分化的 M1 巨噬細胞類似，用 LPS 處理的 Raw264.7 細胞顯著誘導 ASCs 中的 TSG-6 表達。這些結果表明，如果巨噬細胞和間充質(zhì)干細胞共存于炎癥或損傷部位，它們都過度表達TSG-6。

圖1 與巨噬細胞間接共培養(yǎng)的ASCs中的TSG-6 mRNA表達。ASCs與巨噬細胞間接共培養(yǎng)2天，并通過qPCR評估TSG-6 mRNA表達。

用細胞因子組合處理的 ASCs 和巨噬細胞中的 TSG-6 表達

由于巨噬細胞分泌的TNF-α和IL-1β可以誘導TSG-6表達，因此實驗研究了IFN-γ和LPS、TNF-α或IL-1β是否在ASCs中TSG-6表達的增加中起作用。在用IFN-γ和LPS，TNF-α或IL-1β單獨處理的ASCs中，僅在長時間（300秒）后檢測到升高的TSG-6水平。然而，在用IFN-γ，LPS和TNF-α聯(lián)合處理的ASCs中，即使在短時間（22秒）也觀察到TSG-6表達顯著增加，這種增加取決于TNF-α的劑量（圖2 A，lanes 5和6），但不是 IL-1β （圖2 A，lanes 7和8）。然而，當用四種因子處理細胞時，觀察到最大的TSG-6表達（圖2 A，lanes 9 和10）。這些結果表明，幾種炎性細胞因子的協(xié)同作用是TSG-6在ASCs中最佳表達所必需的。

相比之下，與用IFN-γ和LPS處理的細胞相比，用IFN-γ、LPS和TNF-α組合處理觀察到巨噬細胞中的TSG-6表達增加（圖2 B，lanes 5）。這些結果表明，誘導TSG-6表達的條件因細胞類型而異，并且ASCs可以通過比巨噬細胞更敏感地對炎癥條件做出反應來表達TSG-6。

圖2 TSG-6在用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理的ASCs和巨噬細胞中的表達。用不同濃度的TNF-α、IL-1β和/或IFN-γ（20 ng/mL）+ LPS（10pg/mL）處理ASCs或巨噬細胞48 h，采用免疫印跡法檢測細胞裂解物和培養(yǎng)上清液中TSG-6表達。（A） ASCs中的TSG-6表達。（B）巨噬細胞中的TSG-6表達。

TSG-6 表達的信號轉(zhuǎn)導者和轉(zhuǎn)錄激活者（STAT）信號通路的激活

接下來，研究了由IFN-γ和LPS激活的STAT通路是否參與TSG-6表達。

在ASCs和巨噬細胞中，IFN-γ + LPS處理，但不是TNF-α或IL-1β處理，誘導STAT1/3在15分鐘磷酸化。抑制STAT活性的Janus激酶（JAK）抑制劑降低了細胞因子聯(lián)合處理誘導的TSG-6表達（圖3 A）。此外，在間接共培養(yǎng)的ASCs和巨噬細胞中也觀察到TSG-6表達的降低（圖3 B、C）。這些結果表明，STAT信號通路誘導ASCs和巨噬細胞中的TSG-6表達。此外，STAT活性誘導了TNF-α + IL-1β處理過程中TSG-6的協(xié)同表達。

總之，IFN-γ + LPS、TNF-α或IL-1β可以在ASCs和巨噬細胞中誘導TSG-6表達，當ASCs和巨噬細胞在STAT激活條件下暴露于TNF-α或IL-1β時，可能會出現(xiàn)TSG-6過表達。

圖3 JAK抑制劑抑制TSG-6表達。在細胞因子處理或共培養(yǎng)前20分鐘用JAK抑制劑（JAK1和JAK2抑制劑各10μM）處理細胞。刺激后48 h回收細胞裂解物，并使用免疫印跡分析TSG-6表達。（A）用TNF-α，IL-1β和/或IFN-γ + LPS處理后ASCs中的TSG-6表達。共培養(yǎng)后ASCs（B）或巨噬細胞（C）中的TSG-6表達。

TSG-6 在 ASCs 和巨噬細胞中表達的抗纖維化作用

TSG-6除了具有代表性的抗炎特性外，還可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路來調(diào)節(jié)纖維化。因此，實驗研究了ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6是否可以調(diào)節(jié)TGF-β誘導的LX-2（人肝星狀細胞）細胞的纖維化過程。

在LX-2細胞中，TGF-β誘導Smad3磷酸化和α-SMA表達，TSG-6顯著降低了這些表達（圖4 A、B）。此外，TGF-β誘導的α-SMA表達在與ASCs和巨噬細胞間接共培養(yǎng)的LX-2細胞中顯著降低。

接下來，為了確定LX-2中α-SMA表達的降低是否依賴于ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6，使用siRNA研究了TSG-6沉默后α-SMA的表達。結果表明，TSG-6 siRNA 處理的 ASCs 和 Raw 264.7 巨噬細胞中 TSG-6 表達顯著降低，導致TGF-β暴露的LX-2細胞中α-SMA表達的恢復。

這些結果表明，TSG-6可以通過抑制LX-2細胞中的Smad3磷酸化來降低α-SMA表達，ASCs和巨噬細胞表達的TSG-6調(diào)節(jié)LX-2細胞的纖維化活性。

圖4 TSG-6在TGF-β處理的LX-2細胞中的抗纖維化作用。

（A）TSG-6在TGF-β處理的LX-2細胞中抑制α-SMA表達。（B）TSG-6抑制Smad3磷酸化。下室中的LX-2細胞與接種在上室的ASCs和巨噬細胞共培養(yǎng)。抑制α-SMA的表達在與ASCs和巨噬細胞共培養(yǎng)的LX-2細胞中（C）或ASCs和RAW 264.7巨噬細胞中（D）。

這些研究結果表明，通過激活STAT1/3增加TSG-6表達，全面的炎癥微環(huán)境可能在確定ASCs的治療特性方面發(fā)揮重要作用。總之，考慮MSC移植過程中的炎癥環(huán)境對于增強MSCs和巨噬細胞表達的TSG-6的抗炎和抗纖維化特性非常重要。

參考文獻：Gong SC, Yoon Y, Jung PY, Kim MY, Baik SK, Ryu H, Eom YW. Antifibrotic TSG-6 Expression Is Synergistically Increased in Both Cells during Coculture of Mesenchymal Stem Cells and Macrophages via the JAK/STAT Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13122. doi: 10.3390/ijms232113122. PMID: 36361907; PMCID: PMC9656625.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36361907/

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